Электронная микроскопия — один из основных вирусологических методов, благодаря которому мы изучаем форму, строение и размеры бактериальных вирусов.

В настоящем разделе будут описаны электронно-микроскопические методики, которые чаще всего применяются в исследовании фагов. Информацию об устройстве прибора и о физических процессах в электронном микроскопе читатель может получить в специальных руководствах.

а) Приготовление пленок-подложек. Исследуемый материал должен быть нанесен на так называемые пленки-подложки, имеющие толщину не более 0,02-0,05 мк. Пленки из пластиков (коллодий, формвар и др.) или углерода наносятся на специальные опорные сетки из металла. Благодаря этому обеспечивается механическая прочность подложки при электронной бомбардировке.

Пленки из коллодия готовят следующим образом. Каплю 1% раствора коллодия в амилацетате наносят на поверхность воды в чашке Петри. После испарения амилацетата плавающая на воде пленка хорошо просматривается. На эту пленку при помощи специального пинцета накладывают опорные сетки. Расстояние между сетками должно составлять 1,5-2 мм. Группу сеток на пленке накрывают листком фильтрованной бумаги, который быстро пропитывается водой.

При этом сетки прижимаются к листку снизу пленкой. На следующей стадии листок с сетками снимают с поверхности воды и высушивают в термостате. Сетки с коллодиевой пленкой на фильтрованной бумаге следует хранить в каком-либо закрытом сосуде (например, в чашке Петри) во избежание загрязнений из воздуха.

При получении подложек из формвара используют другую методику. Первоначально готовят 0,1-0,15% раствор формвара в дихлорэтане. В этот раствор погружают чистое стекло, сразу же его вынимают и подсушивают при комнатной температуре. После испарения растворителя формваровая пленка остается на стекле. Края стекла зачищают скальпелем, ограничивая определенный фрагмент пленки. Далее стекло медленно погружают в воду в наклонном положении.

При этом пленка отделяется от стекла и переходит на водную поверхность. На нее накладывают сетки. После этого используется тот же прием с фильтрованной бумагой, который описан выше.

б) Нанесение на подложку фагового препарата. Для электронно-микроскопического исследования используют фаговые суспензии, содержащие не менее 106 част./мл. Каплю такого образца наносят на пленку. Через 1 мин жидкую фазу удаляют фильтрованной бумагой. При этом нельзя допускать полного подсыхания поверхности подложки. Адсорбированные на пленке фаговые частицы сразу же обрабатывают специальным контрастирующим агентом.

в) Негативное контрастирование фаговых препаратов. Метод негативного контрастирования обеспечивает изучение тонкого строения бактериального вируса. Суть этого метода сводится к следующему. Нанесенные на подложку фаги обрабатывают специальными солями на основе металлов, сильно рассеивающих электроны (вольфрам, уран и др.). Химические элементы, из которых состоит бактериальный вирус, практически не рассеивают электроны. В связи с этим фаговая частица выглядит светлой на фоне более темного контрастера. Контрастирующий агент способен проникать в тончайшие капилляры фага. Так, канал стержня фага Т-четной серии Е. coli визуализируется благодаря проникновению в него контрастера.

Для многих бактериальных вирусов в качестве негативного контрастирующего вещества используют натриевую соль фосфорно-вольфрамовой кислоты (ФВК). Рабочим раствором для обработки материала служит 2% раствор ФВК, pH которого доведен до 6,5-7,0 при помощи NaOH. Другим широко используемым контрастирующим агентом является 1% незабуференный водный раствор уранилацетата (pH 4,2). В практике электронной микроскопии вирусов применяются и другие контрастеры, в том числе молибдат аммония (pH 6,5) и незабуференный метиламиновольфрамат (pH 6,4).

г) Контроль увеличения при электронной микроскопии. Увеличение на электронных микрофотографиях должно быть откалибровано. Для этой цели используются маркеры с хорошо известными размерами. Эти частицы помещают на одну и ту же сеточку вместе с исследуемыми фагами. Один из лучших внутренних маркеров — кристаллы каталазы (период 17,2 нм). Многие исследователи используют для калибровки увеличения частицы вируса табачной мозаики (ВТМ), шаг спирали которого составляет 2,3 им.

- Читать далее "Применение бактериофагов: реакция нарастания титра фага"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 21.07.2019