Большинство патогенных и условно-патогенных микроорганизмов растет в термостате при температуре 37 °С. Рост на питательных средах обычно учитывают через 24 ч после посева. Рост возбудителей некоторых болезней (туберкулеза, бруцеллеза) становится видимым через 15-30 дней. Скорость роста бактерий зависит от их биологических свойств и условий культивирования (температура, наличие или отсутствие кислорода, углекислого газа, давление и др.).

Аэрация способствует ускоренному росту аэробов. Наряду со строгими (облигатными) аэробами (холерный вибрион) и анаэробами (палочки столбняка, газовой гангрены и др.) факультативные (необязательные) анаэробы и аэробы развиваются и при наличии кислорода, и в бескислородных условиях. Известны также микробы-микроаэрофилы, хорошо растущие при наличии незначительного количества кислорода (некоторые лучистые грибы и др.). Наиболее многочисленной' группой бактерий являются факультативные анаэробы и аэробы, использующие для дыхания свободный кислород воздуха. К ним относятся такие болезнетворные виды, как палочки брюшного тифа, дизентерии и многие другие. Для культивирования строгих анаэробов создаются бескислородные условия культивирования.

В состав питательных сред, применяемых для выращивания большинства бактерий, входят необходимые для построения клеток азот, углерод, водород, кислород, неорганические соединения, содержащие фосфор, калий, серу, натрий, магний, железо, микроэлементы — кобальт, йод, марганец, бор, цинк, молибден, медь и др. При культивировании патогенных микробов необходимо обеспечить для них наличие в питательной среде готовых органических веществ животного и растительного происхождения.

Источники углерода и азота в питательных средах. По характеру усвоения азота патогенные микроорганизмы делятся на способные извлекать азот из простых аммонийных соединений, нуждающиеся в аминокислотах и расщепляющие высокомолекулярные вещества — пептоны.

Аминокислоты обычно добавляют в концентрации 10 мкг на 1 мл среды. Обычно D, L-соединения действуют аналогично L-соединениям, однако D-изомеры иногда могут оказаться ингибиторами. Строго паразитические виды бактерий развиваются только в присутствии нативного, т. е. неизмененного, белка.

Универсальными источниками углерода и азота с повышенной питательной ценностью являются различные продукты специальной обработки мяса животных, главным образом крупного рогатого скота, конины, а также казеина, дрожжевой биомассы соевых бобов и др.

1. Продукты переработки мяса животных (крупного рогатого скота, конины, крольчатины, курятины, ластоногих). Основными продуктами, получаемыми из мяса животных и используемыми для приготовления питательных сред, являются мясная вода, мясной экстракт, ферментативные и кислотные гидролизаты.

Мясную воду (мясной настой, мясной инфуз) получают из фарша, приготовленного из очищенной мышечной ткани. К фаршу добавляют воду в отношении 1:2 и оставляют при 4-10 °С на 18-24 ч, после чего смесь кипятят в течение 1 ч и фильтруют для отделения фарша. С целью увеличения концентрации мясной воды соотношение мясного фарша и воды можно менять до 1:1 и меньше, а при последующем изготовлении среды ее соответственно разводят. При использовании мяса низкого качества рекомендуется соотношение 1:1; такую мясную воду используют без разведения.

В мясной воде (1:1) должно содержаться (% масс): общего азота —0,3, аминного — 0,07, сухих веществ - 2,4-2,8, белка — 0,45.

Для приготовления широко используемых сред МПА и МГ1Б к мясной воде добавляют пептон и натрия хлорид в концентрациях 1 и 0,5% соответственно.

Для культивирования патогенных микроорганизмов, особенно требовательных к питательным средам, к мясопептонным средам добавляют различные обогащающие их компоненты — кровь, сыворотку, яичный желток, сахара и др.

Мясной экстракт получают главным образом при продолжительной варке мясного фарша в автоклаве с последующей выпаркой мясного бульона в вакуум-аппарате до образования пастообразного продукта (содержание воды — 18%, органических веществ — 61%, минеральных — 21%); при этом теряется ряд термолабильных веществ, содержащихся в мясной воде. Мясные экстракты выпускают и в виде сухих порошков, легко растворимых в воде и содержащих в среднем 12% общего азота, 1,1% — аминного азота, 15,6% — минеральных веществ.

При приготовлении питательных сред мясную воду нередко заменяют мясным экстрактом.

Пептоны. Важнейшим компонентом многих питательных сред являются пептоны-продукты ферментативного гидролиза белков мяса. В микробиологической практике в основном применяются пептоны, получаемые при помощи пепсина, панкреатина, трипсина, используемых как в виде частично очищенных, так и «сырых» препаратов. К числу «сырых» препаратов относятся измельченные ткани желудков свиней и поджелудочных желез свиней и рогатого скота.

Под действием указанных ферментов образуются полипептиды различной степени сложности и свободные аминокислоты, однако следует учитывать, что пептоны, получаемые с использованием препаратов, содержащих пепсин, и препаратов, содержащих панкреатин, различаются по глубине гидролиза белков.

Пепсинные пептоны (пептон, пепсин-пептон, пептон по Рамону, он же Thitone, Pepton, Bio-Thion, Peptamin идр.) содержат в большом количестве высокомолекулярные пептиды — продукты неглубокого гидролиза белков. Панкреатические пептоны (панкреатический перевар мяса, триптический перевар мяса, триптон, он же Myosate, Amber MPH, Peptone, Proteose-Peptone и др.) представляют собой смесь продуктов более глубокого гидролиза — простых полипептидов, пептонов и большого количества свободных аминокислот, о чем свидетельствует и высокое содержание в этих пептонах аминного азота — до 1200 мг%.

Пептоны выпускают в сухом виде (желто-бежевый порошок). Они характеризуются высокой питательной ценностью для микроорганизмов, но одновременно и значительным недостатком — нестандартностью. Повышенная вариабельность пептонов по составу и питательной ценности обусловлена не только нестандартностью исходного сырья — мяса, но и нестандартностью источников ферментов — желудков, поджелудочных желез, получаемых от разных животных и хранящихся в разных условиях. В России на основе гидролизатов мяса выпускаются готовые к применению МПА (мясопептонный агар) и МПБ (мясопептонный бульон), агар и бульон Хоттингера, а также сухие ГМФ-агар и ГМФ-бульон (на основе ферментативного гидролизата мясного фарша).

В качестве питательных компонентов многих сред (питательных бульонов, питательных агаров и др.) могут быть использованы не только гидролизаты мяса, но и других белковых субстратов — казеина, рыбных продуктов, растительных белков.

2. Продукты переработки рыбы с успехом используются при получении высокопитательных сред для микроорганизмов, так как по химическому составу мясо рыбы практически не отличается от мяса животных. В нашей стране выпускаются в сухом виде и широко применяются в микробиологической практике среды общего назначения на основе панкреатического гидролизата кильки — питательный бульон (СПБ) и питательный агар (СПА), а на основе панкреатического гидролизата рыбной муки — ГРМ-бульон и ГРМ-агар.

3. Казеин — фосфорсодержащий белок, получаемый из обезжиренного молока и являющийся наиболее полноценным видом сырья для изготовления питательных сред. От других источников белка отличается большим постоянством состава, содержит все аминокислоты и некоторые витамины.

Кислотные гидролизаты казеина получают с использованием высоких температур (110°С и выше) и крепкой соляной кислоты. В данных условиях достигается почти полный его гидролиз до аминокислот. Однако при этом разрушаются углеводы, триптофан, цистин и частично треонин и серин, а содержание натрия хлорида увеличивается до 38-40%.

Ферментативные гидролизаты казеина: панкреатический гидролизат казеина (триптический гидролизат, панкреатический перевар) получают с использованием ферментов поджелудочной железы, а пептический — с использованием пепсина. Ферментативные гидролизаты казеина содержат низкомолекулярные пептиды, аминокислоты, в том числе и триптофан, соотношение которых в составе гидролизатов варьирует в зависимости от способа их получения.

Ферментативные и кислотные гидролизаты казеина выпускаются в виде сухих порошков. Питательные среды на основе различных гидролизатов казеина используются в диагностике инфекционных заболеваний.

4. Продукты переработки дрожжей (кормовых, пивных). Источником углерода, азота и других компонентов для многих сред общего и специального назначения могут быть также продукты, получаемые из дрожжей, — дрожжевая вода, дрожжевой настой, дрожжевой автолизат, дрожжевой экстракт, кислотный гидролизат, ферментативный гидролизат. Для получения этих продуктов используют главным образом хлебопекарные дрожжи рода Sacharomyces и кормовые дрожжи родов Candida и Torulopsis. Дрожжи содержат до 53% белка, 25-40% углеводов, являются богатым источником витаминов группы В, витамина D и таких факторов роста, как пуриновые и пиримидиновые основания.

Белок дрожжей сбалансирован по аминокислотному составу и по этому показателю близок к животному белку. Наиболее широко используются в промышленных масштабах дрожжевой авголизат, дрожжевые экстракты и гидролизаты дрожжей.

Дрожжевой автолизат. Дрожжевые клетки содержат значительное количество различных протеолитических ферментов (пепсиназа, триптаза, эритаза и др.), под действием которых в определенных условиях происходит автолиз клеток и высвобождение из них белков в виде пептонов, альбумоз, а также аминокислот, нуклеиновых кислот и др. Эти компоненты и определяют состав автолизата, который сопоставим с триптическим гидролизатом других белков, в том числе и по содержанию аминного азота дрожжевого автолизата, достигающего 1000-1200 мг%.

Дрожжевые экстракты представляют собой водные экстракты из дрожжей, которые предварительно гидролизуют или подвергают автолизу.

Дрожжевой автолизат и дрожжевые экстракты выпускаются в виде густых сиропов или мелкодисперсных порошков.

Гидролизаты дрожжей получают при помощи ферментов или кислот. По основному химическому составу, а именно, по содержанию общего и аминного азота, триптофана, они сходны с мясными гидролизатами, а пептонов в дрожжевых гидролизатах больше, чем в мясных. На бульонах из гидролизатов дрожжей хорошо проявляется рост энтеробактерий, кокков и коринебактерий.

Кислотный гидролизат получают с использованием фосфорной или соляной кислот, а ферментативный — поджелудочной железы или панкреатина.

5. Продукты растительного происхождения. В последние годы активно разрабатываются питательные среды на основе растительных пептонов, экстрактов и гидролизатов. В качестве основ для питательных сред используют продукты, получаемые из растительного сырья, прежде всего из бобов сои, богатых белком, витаминами, минеральными веществами; помимо сои используются рис, картофель, пшеница, кукуруза. Путем ферментативного (бромалин, папаин) и кислотного гидролиза получено около 15 растительных пептонов (HiVeg™ peptones), эквивалентных по своим свойствам известным пептонам и экстрактам животного происхождения — мясному экстракту, мясному и желатиновому пептону, триптону, кислотному гидролизату казеина и лактальбумина, говяжьему и печеночному экстракту.

На основе этих стопроцентно растительных пептонов разработаны составы более 750 сред (HiVeg™ Dehydrated Culture Media), равноценных по чувствительности, скорости роста микроорганизмов, а также дифференцирующим и ингибирующим свойствам хорошо известным стандартным питательным средам, предназначенным как для культивирования различных патогенных и непатогенных микроорганизмов (коли-формы, стафилококки, сальмонеллы, листерии, бруцеллы, дрожжи и др.), так и для выделения их из различного материала (пищевые продукты, вода, почва, клинический материал) при диагностике различных заболеваний, а также определения качества продуктов и воды (например, С. L. Е. D. HiVeg Agar, Bismuth Sulphite HiVeg Agar, MacConkey HiVeg Agar, Endo HiVeg Agar и др.).

Преимущественными методами приготовления таких питательных сред являются ферментативный и кислотный гидролиз сои.

Ферментативный гидролиз осуществляют с использованием пепсина, папаина, панкреатина, а кислотный —с применением соляной кислоты. Высокая питательная ценность этих гидролизатов подтверждается тем, что, например, на средах с папаиновым гидролизатом сои и без добавления сыворотки и факторов роста хорошо растут стрептококки, гонококки и другие требовательные к среде бактерии. Соевый бульон в некоторых случаях может заменить мясной бульон.

Соевые гидролизаты в различных странах выпускают под названиями «Phytone», «Soytone», «Soya Pentone», «Ыо-Soyase».

Вышеуказанные продукты переработки мяса животных, рыбы, казеина, дрожжей, растительного сырья представляют собой органические источники углерода и азота. Однако многие микроорганизмы наиболее легко усваивают аминный азот, источником которого являются различные неорганические соли аммония.

- Читать далее "Источники углеводов, фосфора, серы, металлов, солей в питательных средах"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 18.05.2019