Люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия основана на способности некоторых веществ люминесцировать, т.е. светиться при освещении невидимым ультрафиолетовым или синим светом. Цвет люминесценции смещен в более длинноволновую часть спектра по сравнению с возбуждающим ее светом (правило Стокса).

При возбуждении люминесценции синим светом цвет ее может быть от зеленого до красного. Если люминесценция возбуждается ультрафиолетовым излучением, то свечение может быть в любой части видимого спектра. Эта особенность люминесценции позволяет при использовании специальных светофильтров, поглощающих возбуждающий свет, наблюдать сравнительно слабое люминесцентное свечение.

В осветителе люминесцентного микроскопа используется мощный источник света (ртутно-кварцевая лампа сверхвысокого давления или галогенная кварцевая лампа), излучение которого преимущественно соответствует коротковолновой (ультрафиолетовой, синей) части спектра. Используется система светофильтров: возбуждающие светофильтры пропускают только ту часть спектра, которая возбуждает люминесценцию; теплозащитный светофильтр защищает от перегрева другие светофильтры, препарат и оптику люминесцентного микроскопа.

В некоторых отечественных люминесцентных микроскопах теплозащитную функцию, кроме того, выполняет кювета с плоскопараллельными стеклами, заполненная дистиллированной водой. «Запирающие» светофильтры расположены между препаратом и окуляром. Эти светофильтры поглощают возбуждающее излучение и пропускают свет люминесценции от препарата к глазу наблюдателя.

В нашей стране разработан эффективный способ освещения препаратов для возбуждения люминесценции, который заключается в том, что препарат освещают светом, падающим на него через объектив. Благодаря этому освещенность увеличивается при использовании объектов, имеющих большую числовую апертуру, т. е. тех, которые используются для изучения микроорганизмов.

Важную роль при этом способе освещения играет специальная интерференционная светоделительная пластинка, направляющая свет в объектив. Она представляет собой полупрозрачное зеркало, избирательно отражающее и направляющее в объектив часть спектра, которая возбуждает люминесценцию, а пропускает в окуляр свет люминесценции. Оптика объективов люминесцентного микроскопа изготавливается из нелюминес-цирующих оптического стекла и клея. На оправе таких объективов выгравирована буква «Л». При работе с объективами масляной иммерсии используется нелюми-несцирующее иммерсионное масло.

Поскольку большинство микроорганизмов не обладает собственной люминесценцией, существует несколько способов их обработки для наблюдения в люминесцентном микроскопе. Прежде всего это флюорохромирование — окрашивание сильно разведенными (до нескольких микрограмм на 1 мл) растворами флюоресцирующих красителей (флюорохромов). Этот метод используется для бактериоскопического исследования возбудителей инфекций: туберкулеза (ауромин), дифтерии (корифосфин), включений в клетках, образуемых некоторыми вирусами (примулин), и др.

Люминесцентная микроскопия может применяться также для цитохимического изучения живых и фиксированных микроорганизмов: некоторые флюорохромы избирательно связываются с полимерами клетки (акридиновый оранжевый связываясь с ДНК, флюоресцирует зеленым, а с РНК — красным цветом). В реакции иммунофлюоресценции при помощи антител, меченных флюорохромами (ФИТЦ — флюоресцеинизотиоционат и др.), выявляются антигены микроорганизмов или антитела в сыворотке больных.

- Читать далее "Электронная микроскопия"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 9.05.2019