Окраска клеточной стенки, жгутиков микроорганизмов
При обычных способах окраски выявить клеточную стенку микроорганизмов невозможно. Для ее контрастирования мазок нуждается в специальной обработке, предшествующей окрашиванию. Препарат готовят из сильно разбавленной микробной взвеси, чтобы между микробными телами было свободное пространство, и клетки не накладывались бы друг на друга.
а) Окраска клеточной стенки по способу Гутштейна:
• Препарат, приготовленный из микробной взвеси, подсушивают на воздухе.
• Фиксируют в жидкости Буэна 3 мин.
• Протравливают 25 мин 10% (вес/объем) водным раствором танина.
• Промывают водопроводной водой.
• Окрашивают 0,02% спиртоводным раствором кристаллического фиолетового 30-60 с.
• Остаток краски сливают и препарат, не промывая водой, высушивают.
При микроскопии клеточные стенки имеют вид длинных тонких нитей темно-фиолетового или черного цвета, очерчивающих тела клеток с белой или светло-голубой цитоплазмой.
б) Окраска жгутиков бактерий. Подвижные бактерии в зависимости от количества и расположения жгутиков подразделяются на монотрихи — с одним жгутиком, амфитрихи жгутики расположены по полюсам клетки, лофотрихи — клетки, имеющие пучок жгутиков на одном из полюсов, перитрихи — клетки со жгутиками по всей поверхности тела.
Окрашиваются жгутики с трудом, поэтому для их окраски применяют протравы, которые увеличивают толщину жгутиков и повышают возможность их окраски.
При изготовлении препаратов для обнаружения жгутиков необходимо пользоваться очень чистыми хорошо обезжиренными стеклами. Рекомендуется работать с новыми покровными стеклами, которые предварительно 10 мин кипятят в хромовой смеси. После кипячения стекла промывают в течение 5 мин в слабом растворе гидроксида натрия (NaOH), после чего обильно промывают водой, ополаскивают спиртом и помещают в банки со смесью Никифорова. Из банок стекла вынимают чистым пинцетом, смесь Никифорова удаляют прожиганием стекла на огне.
При изготовлении препаратов используют молодые микробные культуры (12-16-часовые), выращенные при оптимальной для данного вида микроба температуре.
1. Окраска жгутиков бактерий методом серебрения по Морозову:
• Для приготовления мазка берут наиболее подвижные 12-16-часовые микробные культуры, выращенные в оптимальных температурных условиях.
• Прокаленной и охлажденной петлей слегка прикасаются к поверхности колоний или газонного роста микробной культуры, чтобы не вызвать механического повреждения жгутиков.
• Полученный материал переносят в преципитационную пробирку, на дно которой налито 0,1-0,2 мл 1% раствора формалина. Петлю оставляют в неподвижном состоянии на несколько минут. За это время часть микробов «переходит» с петли в раствор. Эту процедуру повторяют 2-3 раза, пока жидкость не станет слабоопалесцировать.
• Приготовленную взвесь ставят на 1 -2 ч в термостат при 37 °С для равномерного распределения микроорганизмов в жидкой среде.
• Затем в пробирку с 1,5-2 мл дистиллированной воды вносят 1-2 капли формалиновой бактериальной взвеси. Через 10-15 мин, после того как бактерии относительно равномерно распределятся по всему объему жидкости, наносят 5-6 капель полученной взвеси на предметное стекло, не касаясь его петлей.
• Капли высушивают на воздухе, не размазывая.
• Для лучшего протравливания обрабатывают их ледяной уксусной кислотой с формалином в течение 1 мин.
• Остатки протравы сливают, мазок промывают водой.
• После подсыхания мазка препарат подвергают действию второго реактива — танина с карболовой кислотой. В течение 1 мин мазки нагревают на легком пламени до появления паров. После обработки препарат тщательно промывают водопроводной водой в течение нескольких минут.
• На подсушенный после промывания препарат наносят AgNO3 — нитрат серебра и выдерживают его до тех пор, пока мазок не приобретет темно-коричневую окраску.
• Окрашенный мазок тщательно промывают водопроводной водой, подсушивают и микроскопируют.
При обработке мазков таниновыми препаратами жгутики бактерий становятся более рыхлыми, объемистыми и доступными для воздействия на них азотистого серебра. Увеличенные в объеме жгутики становятся хорошо видимыми при иммерсионной микроскопии. Тела микробных клеток окрашиваются в угольно-черный цвет, жгутики приобретают различные оттенки коричневого цвета и отчетливо видны на окрашенном в слабо-желтый цвет фоне.
2. Метод окрашивания жгутиков по Грею:
• Культуру исследуемого микроба выращивают на поверхности скошенного агара.
• За 30 мин до постановки опыта добавляют в пробирку с культурой 1,5-2 мл водного раствора пептона, в который переходят подвижные бактерии.
• Взвесь микробов в пептонной воде центрифугируют для освобождения от составных элементов среды.
• Осадок осторожно, чтобы не повредить жгутики, ресуспендируют в 10% (объем/объем) водном растворе формалина до получения слегка мутной суспензии.
• Приготовленную суспензию наносят на предметное стекло, наклоненное под углом 45°. Подсушивают на воздухе.
• Подсохший мазок подвергают действию протравы — смеси калий-алюминия сульфата, водного раствора танина и насыщенного водного раствора хлорида ртути продолжительностью не менее 6 мин.
• После обработки протравой мазок промывают водопроводной водой.
• На промытый мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги и наливают на него карболовый фуксин Циля на 3 мин.
• Через 3 мин фильтровальную бумагу удаляют, препарат снова промывают дистиллированной водой, подсушивают и просматривают с иммерсионным объективом.
Клетки и жгутики бактерий окрашиваются фуксином в пунцовый цвет, фон препарата обесцвечен или имеет слабо-розовый цвет.
Успех окраски зависит от чистоты используемых стекол. Поэтому рекомендуется прожигать их в пламени горелки Бунзена до тех пор, пока края стекол не приобретут желтый цвет, или прогревать в муфельной печи 20 мин при 400 °С. После охлаждения стекла немедленно стерилизуют.
- Читать далее "Химический состав микроорганизмов"
Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 16.05.2019