При обычных способах окраски выявить клеточную стенку микроорганизмов невозможно. Для ее контрастирования мазок нуждается в специальной обработке, предшествующей окрашиванию. Препарат готовят из сильно разбавленной микробной взвеси, чтобы между микробными телами было свободное пространство, и клетки не накладывались бы друг на друга.

а) Окраска клеточной стенки по способу Гутштейна:

• Препарат, приготовленный из микробной взвеси, подсушивают на воздухе.

• Фиксируют в жидкости Буэна 3 мин.

• Протравливают 25 мин 10% (вес/объем) водным раствором танина.

• Промывают водопроводной водой.

• Окрашивают 0,02% спиртоводным раствором кристаллического фиолетового 30-60 с.

• Остаток краски сливают и препарат, не промывая водой, высушивают.

При микроскопии клеточные стенки имеют вид длинных тонких нитей темно-фиолетового или черного цвета, очерчивающих тела клеток с белой или светло-голубой цитоплазмой.

б) Окраска жгутиков бактерий. Подвижные бактерии в зависимости от количества и расположения жгутиков подразделяются на монотрихи — с одним жгутиком, амфитрихи жгутики расположены по полюсам клетки, лофотрихи — клетки, имеющие пучок жгутиков на одном из полюсов, перитрихи — клетки со жгутиками по всей поверхности тела.

Окрашиваются жгутики с трудом, поэтому для их окраски применяют протравы, которые увеличивают толщину жгутиков и повышают возможность их окраски.

При изготовлении препаратов для обнаружения жгутиков необходимо пользоваться очень чистыми хорошо обезжиренными стеклами. Рекомендуется работать с новыми покровными стеклами, которые предварительно 10 мин кипятят в хромовой смеси. После кипячения стекла промывают в течение 5 мин в слабом растворе гидроксида натрия (NaOH), после чего обильно промывают водой, ополаскивают спиртом и помещают в банки со смесью Никифорова. Из банок стекла вынимают чистым пинцетом, смесь Никифорова удаляют прожиганием стекла на огне.

При изготовлении препаратов используют молодые микробные культуры (12-16-часовые), выращенные при оптимальной для данного вида микроба температуре.

1. Окраска жгутиков бактерий методом серебрения по Морозову:

• Для приготовления мазка берут наиболее подвижные 12-16-часовые микробные культуры, выращенные в оптимальных температурных условиях.

• Прокаленной и охлажденной петлей слегка прикасаются к поверхности колоний или газонного роста микробной культуры, чтобы не вызвать механического повреждения жгутиков.

• Полученный материал переносят в преципитационную пробирку, на дно которой налито 0,1-0,2 мл 1% раствора формалина. Петлю оставляют в неподвижном состоянии на несколько минут. За это время часть микробов «переходит» с петли в раствор. Эту процедуру повторяют 2-3 раза, пока жидкость не станет слабоопалесцировать.

• Приготовленную взвесь ставят на 1 -2 ч в термостат при 37 °С для равномерного распределения микроорганизмов в жидкой среде.

• Затем в пробирку с 1,5-2 мл дистиллированной воды вносят 1-2 капли формалиновой бактериальной взвеси. Через 10-15 мин, после того как бактерии относительно равномерно распределятся по всему объему жидкости, наносят 5-6 капель полученной взвеси на предметное стекло, не касаясь его петлей.

• Капли высушивают на воздухе, не размазывая.

• Для лучшего протравливания обрабатывают их ледяной уксусной кислотой с формалином в течение 1 мин.

• Остатки протравы сливают, мазок промывают водой.

• После подсыхания мазка препарат подвергают действию второго реактива — танина с карболовой кислотой. В течение 1 мин мазки нагревают на легком пламени до появления паров. После обработки препарат тщательно промывают водопроводной водой в течение нескольких минут.

• На подсушенный после промывания препарат наносят AgNO₃ — нитрат серебра и выдерживают его до тех пор, пока мазок не приобретет темно-коричневую окраску.

• Окрашенный мазок тщательно промывают водопроводной водой, подсушивают и микроскопируют.

При обработке мазков таниновыми препаратами жгутики бактерий становятся более рыхлыми, объемистыми и доступными для воздействия на них азотистого серебра. Увеличенные в объеме жгутики становятся хорошо видимыми при иммерсионной микроскопии. Тела микробных клеток окрашиваются в угольно-черный цвет, жгутики приобретают различные оттенки коричневого цвета и отчетливо видны на окрашенном в слабо-желтый цвет фоне.

2. Метод окрашивания жгутиков по Грею:

• Культуру исследуемого микроба выращивают на поверхности скошенного агара.

• За 30 мин до постановки опыта добавляют в пробирку с культурой 1,5-2 мл водного раствора пептона, в который переходят подвижные бактерии.

• Взвесь микробов в пептонной воде центрифугируют для освобождения от составных элементов среды.

• Осадок осторожно, чтобы не повредить жгутики, ресуспендируют в 10% (объем/объем) водном растворе формалина до получения слегка мутной суспензии.

• Приготовленную суспензию наносят на предметное стекло, наклоненное под углом 45°. Подсушивают на воздухе.

• Подсохший мазок подвергают действию протравы — смеси калий-алюминия сульфата, водного раствора танина и насыщенного водного раствора хлорида ртути продолжительностью не менее 6 мин.

• После обработки протравой мазок промывают водопроводной водой.

• На промытый мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги и наливают на него карболовый фуксин Циля на 3 мин.

• Через 3 мин фильтровальную бумагу удаляют, препарат снова промывают дистиллированной водой, подсушивают и просматривают с иммерсионным объективом.

Клетки и жгутики бактерий окрашиваются фуксином в пунцовый цвет, фон препарата обесцвечен или имеет слабо-розовый цвет.

Успех окраски зависит от чистоты используемых стекол. Поэтому рекомендуется прожигать их в пламени горелки Бунзена до тех пор, пока края стекол не приобретут желтый цвет, или прогревать в муфельной печи 20 мин при 400 °С. После охлаждения стекла немедленно стерилизуют.

- Читать далее "Химический состав микроорганизмов"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 16.05.2019