Дифференциальные методы окраски предусматривают следующие процедуры:

• Подготовленный к окраске фиксированный мазок окрашивается первично тем красителем, при помощи которого надеются выявить предполагаемый возбудитель болезни на основании его физико-химических особенностей, определяющих сродство к определенным краскам.

• Поскольку первичное окрашивание распространяется на все микроорганизмы, за ним следует протрава мазка конкретными в каждом случае химическими соединениями — кислотами, спиртом, щелочами, фенолом и пр. Результатом протравы является обесцвечивание всех находящихся в мазке микроорганизмов, кроме искомых потенциальных возбудителей предполагаемого заболевания.

• После протравы проводят вторичное дополнительное окрашивание краской контрастного цвета. Предыдущая протрава способствует прикреплению краски к обесцвеченным клеточным компонентам, и в дополнительный цвет окрашиваются практически все находящиеся в мазке микроорганизмы, за исключением возбудителя болезни.

Многие сложные дифференциально-диагностические методы окраски, как, например, окраска по Граму, определение кислотоустойчивости, зерен волютина и некоторые другие, можно рассматривать как один из первых этапов идентификации микроорганизма.

а) Дифференциальная окраска по методу Грама. В конце XIX столетия датский бактериолог Ханс Христиан Грам предложил метод дифференциальной окраски, позволивший разделить большую часть известных патогенных и условно-патогенных микроорганизмов на две группы — грамположительные и грамотрицательные. Спектр окрашивания по Граму включает подавляющее большинство видов бактерий, имеющих то или иное значение в патологии человека.

Исключение составляют плохо окрашивающаяся Leptospira, не окрашивающиеся Treponema, Mycoplasma, L-формы бактерий, у которых отсутствует клеточная стенка, а также очень мелкие внутриклеточные паразиты Chlamidia и Rikketsia.

Восприимчивость к окраске по Граму определяется толщиной клеточной стенки и ее химической структурой. Клеточная стенка грамположительных микробов представляет собой многослойный пептидогликановый «мешок» толщиной 20-60 нм, форма которого соответствует форме бактериальной клетки. Микрофибриллы пептидогликана, переплетаясь между собой, образуют густую сеть, пронизанную порами. С пептидогликаном клеточной стенки ковалентно связаны тейхоевые и липотейхоевые (от греч. teichos — стенка) кислоты, выступающие на поверхность клетки через поры пептидогликаново-го каркаса.

Способность грамположительных клеток при окраске по Граму удерживать комплекс йода с кристаллическим фиолетовым связана, во-первых, со свойством многослойного пептидогликана взаимодействовать с красителем, и во-вторых, со структурой пор пептидогликана, которая препятствует вымыванию красителя при обработке мазка бактерий спиртом.

Клеточная стенка грамотрицательных бактерий содержит 1-2 слоя пептидогликана, т.е. толщина ее намного меньше (10-20 нм), чем у грамположительных микроорганизмов. В состав клеточной стенки грамотрицательных бактерий также входит наружная мембрана, связанная бимолекулярным слоем липидов поверхностного слоя пептидогликана. Наружная мембрана имеет мозаичную структуру, состоящую из молекул фосфолипидов, полисахаридов и белков. Белки наружной мембраны, получившие название поринов, окружают гидрофильные поры, через которые проходят водные и другие молекулы массой до 800 Да.

Грамотрицательные бактерии при обработке препарата спиртом вследствие недостаточного количества петидогликанов в клеточной стенке утрачивают комплекс йода с кристаллическим фиолетовым, обесцвечиваются и затем приобретают контрастный цвет дополнительного красителя. Чаще всего в качестве дополнительного красителя используют фуксин или сафранин.

Со временем метод окраски по Граму стал основным методом, с которого начинается таксономическая идентификация выделенных от больного патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

Например, обнаружение в клиническом материале или выделение из него грамположительных микроорганизмов сферической формы, расположенных парами в виде коротких цепочек (до 5 кокков) или скоплений, различных по величине и плотности, дают основание, принимая во внимание локализацию патологического процесса (если это не общее заболевание), а также эпидемиологические и клинические наблюдения, направить исследование на выделение Staphylococcus, Enterococcus, Gemella, Stomatococcus, Peptococcus.

При выявлении в питательных средах более или менее длинных цепочек анализ ведется в направлении выявления Streptococcus, а в челюстно-лицевых и стоматологических отделениях — Peptostreptococcus. При грамотрицательном окрашивании кокков внимание клиницистов концентрируется на выявлении и идентификации представителей рода Neisseria.

б) Общепринятый метод окраски бактерий по Граму:

• Приготовленный на предметном стекле тонкий мазок высушивают на воздухе.

• Фиксируют над пламенем горелки.

• На мазок кладут фильтровальную бумагу 2x4 см и наливают на нее раствор основного красителя — кристаллического фиолетового на 1-2 мин.

• Снимают бумагу, сливают остаток краски, не промывая препарат водой, наливают раствор Люголя на 1 -2 мин до почернения препарата.

• Раствор Люголя сливают, предметное стекло для обесцвечивания мазка несколько раз погружают в стаканчик со спиртом. Процесс обесцвечивания считается завершенным, когда от мазка перестают отделяться окрашенные в фиолетовый цвет струйки жидкости.

• Препарат тщательно промывают водопроводной водой.

• Докрашивают препарат водно-спиртовым раствором фуксина в течение 2 мин.

• Окрашенный мазок высушивают и микроскопируют.

Чрезвычайно важно строго соблюдать время обесцвечивания мазка, так как более продолжительная, чем предусмотрено методикой, обработка мазка спиртом ведет к обесцвечиванию грамположительных микроорганизмов, а при недостаточной по времени обработке грамотрицательных микроорганизмов они не успевают обесцветиться и сохраняют фиолетовый цвет основного красителя.

в) Упрощенный метод окраски по Граму, предложенный А. И. Синевым:

• Исследуемый мазок, высушенный и зафиксированный над пламенем горелки, покрывают полоской фильтровальной бумаги, пропитанной 1% раствором кристаллического фиолетового по Синеву. Красящую бумагу смачивают дистиллированной водой, прижимая бактериологической петлей, чтобы бумага плотно прилегала к мазку. Излишнюю воду сливают. Мазок окрашивают 2 мин, следя за тем, чтобы бумага все время оставалась влажной и плотно прилегала к мазку.

• Снимают красящую бумагу. На мазок наливают раствор Люголя и выдерживают до его почернения.

• Сливают со стекла раствор Люголя и обесцвечивают мазок 96% этиловым спиртом в течение 20-30 с.

• На обесцвеченный мазок, без предварительного промывания, кладут фильтровальную бумагу, окрашенную по Синеву фуксином Пфейфера, смачивают ее водопроводной водой и, прижав петлей к мазку, выдерживают 1 мин.

• После окраски мазок высушивают и микроскопируют.

• Препараты, изготовленные по методу Синева, отличаются четкостью и не имеют осадка.

г) Окраска микроорганизмов по Граму в модификации Хукера:

• Нанесенный на предметное стекло мазок высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки.

• Погружают фиксированный мазок в склянку с основным красителем — кристаллическим фиолетовым на 1 мин.

• Окрашенный мазок промывают в слабой струе водопроводной воды в течение 2-3 с.

• Предметное стекло с мазком помещают в йодную протраву — модификацию раствора Люголя на 1 мин.

• Препарат промывают под слабой струей водопроводной воды в течение 2-3 с.

• Подсушивают препарат на воздухе или при помощи фильтровальной бумаги.

• Предметное стекло с мазком помещают в склянку с 95% (по объему) этиловым спиртом на 30 с при постоянном взбалтывании жидкости.

• После обработки этиловым спиртом мазок подсушивают фильтровальной бумагой.

• Погружают предметное стекло с обработанным мазком в склянку с дополнительным красителем — сафранином на 10 с.

• Окрашенный мазок промывают под слабой струей водопроводной воды, подсушивают и микроскопируют.

д) Окраска микроорганизмов по Граму в модификации Бёрка:

• Мазок, приготовленный для окраски, высушивают на воздухе и фиксируют над пламенем горелки.

• Предметное стекло с фиксированным мазком погружают на 2 мин в склянку с раствором кристаллического фиолетового с 2-3 каплями натрия двууглекислого.

• Окрашенный основным красителем мазок промывают йодной протравой, затем на 2 мин наслаивают на него новую протраву.

• Мазок промывают под слабой струей водопроводной воды 2 с. После промывания поверхность препарата вокруг мазка подсушивают фильтровальной бумагой, но сам мазок предохраняют от высыхания.

• Предметное стекло с мазком устанавливают в наклонном положении. На мазок по каплям наносят обесцвечивающий растворитель до тех пор, пока в струйках стекающего со стекла растворителя не исчезнет примесь краски.

• После обесцвечивания мазок подсушивают на воздухе.

• Предметное стекло с высушенным мазком опускают в склянку с дополнительным красителем — сафранином на 5-10 с.

• По окончании окраски мазок снова промывают под слабой струей водопроводной воды до исчезновения в стекающих струйках розоватого цвета.

• Высушенный на воздухе или при помощи фильтровальной бумаги мазок микроскопируют.

При использовании любого варианта окраски по Граму грамположительные бактерии окрашиваются первым красителем — кристаллическим фиолетовым, приобретая темно-фиолетовый цвет. Грамотрицательные микроорганизмы при обработке препарата обесцвечиваются, затем принимают цвет дополнительной контрастной краски — розовой или красной.

В отдельных случаях даже незначительные нарушения методики окрашивания или изменения, происходящие в культуре микробных клеток под влиянием различных, не всегда поддающихся учету факторов, могут дать неправильные результаты окраски по Граму. Грамположительные микроорганизмы при чрезмерном обесцвечивании препарата приобретают розово-красный цвет, характерный для грамотрицательных бактерий. Грамположительные бактерии при механическом нарушении целостности их стенок и при воздействии на них некоторых ферментов, например, лизоцима, приобретают грамотрицательную окраску. Поэтому при окрашивании микробных культур, выделенных из клинического материала, целесообразно в качестве контроля использовать заведомо известные культуры грамположительных и грамотрицательных бактерий или воспользоваться тестом Куи — Грегерсена с гидроксидом калия (КОН).

е) Окраска по Граму в модификации Калины для микроорганизмов группы нейссерий. Микроорганизмы группы нейссерий — грамотрицательны, но при окрашивании по Граму они обесцвечиваются спиртом неравномерно, это относится главным образом к гонококку. Поэтому профессор Г. П. Калина предложил специально для нейссерий щадящий метод окраски:

• На предметное стекло наносят каплю изотонического раствора натрия хлорида и в ней суспендируют исследуемую культуру.

• Добавляют 1 каплю раствора бриллиантового зеленого и распределяют тонким слоем. Диаметр мазка — примерно 1 см.

• Мазок подсушивают на воздухе и фиксируют над пламенем горелки. На фиксированный мазок наносят основной реактив на 1,5-2 мин.

• По окончании времени окрашивания краску сливают и предметное стекло в наклонном положении промывают сначала водопроводной водой, а затем 30% (по объему) раствором этанола до отхождения облачка краски и снова промывают водой.

• Промытый препарат докрашивают водным раствором фуксина в течение 2 мин.

• Мазок окончательно промывают водой, подсушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют.

Грамположительные бактерии приобретают зелено-черный или фиолетовый цвет, грамотрицатсльные — ярко-розовый. Желательно для контроля на отдельном стекле окрашивать мазки культур стафилококка и кишечной палочки.

ж) Тест Куи — Грегерсена с КОН для уточнения сомнительных результатов окраски по Граму. Обычно оценка результатов окраски по Граму не представляет трудностей. Однако в отдельных случаях грамположительные микроорганизмы, например, спороносные палочки, приобретают грамотрицательную окраску, тогда как некоторые штаммы грамотрицательных бактерий родов Acinetobacter и Moraxella имеют тенденцию не обесцвечиваться спиртом, вследствие чего выглядят как грамположительные. Для уточнения таких сомнительных результатов японский ученый Е. Куи в 1938 г. предложил КОН-тест (тест Грегерсена). В основе этого теста лежит способность клеточных стенок грамположительных бактерий, в отличие от грамотрицательных, сохранять целостность при воздействии на них гидроксида калия (КОН).

Для постановки этого теста петлю суточной агаровой культуры испытуемого штамма суспендируют на предметном стекле в капле 3% раствора КОН. При положительной реакции, свойственной грамотрицательным микроорганизмам, через несколько секунд жидкость в капле приобретает слизистую консистенцию, и при отрыве от предметного стекла слизистые нити тянутся на 0,5-2 см. Учет результатов пробы рекомендуется проводить на темном фоне.

Приобретение грамотрицательными бактериями слизистой консистенции при обработке их гидроксидом калия связывают с выходом из клеток ДНК, представляющей собой вязкий компонент.

- Читать далее "Техника окраски кислотоустойчивых микобактерий по методу Циля — Нильсена, Бунге — Траутенроту, Козлова"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 13.05.2019