Для того чтобы увидеть четкие контуры микроорганизмов, применяют метод биологического окрашивания. Клетки окрашенных микроорганизмов отчетливо выделяются на серебристо-белом фоне препарата, создавая яркую картину микробного пейзажа микроскопируемого объекта. Использование специальных методов окраски позволяет выявить некоторые морфологические структуры содержащихся в материале микробных клеток (наличие спор, капсул, жгутиков и пр.).

В микробиологии используют различные красители, подразделяемые по их способности окрашивать определенные структурные образования микробных клеток.

Обычно различают 4 большие группы красителей:

1. Основные (или ядерные) красители, избирательно окрашивающие ядро, и базофильные (от лат. basis — основной) структуры бактериальных клеток.

2. Кислые (или цитоплазматические) красители, которые окрашивают преимущественно цитоплазму, реже клеточные стенки.

3. Нейтральные красители, избирательно окрашивающие отдельные компоненты цитоплазмы; например, судан III или нильский синий окрашивают капельки жира.

4. Флюорохромы — группа красителей, способных флюоресцировать при той или иной длине волны возбуждающего света. Несмотря на то, что флюорохромы выделены в самостоятельную группу, большинство из них следовало бы отнести к цитоплазматическим красителям, реже к ядерным.

В таблице ниже представлены наиболее употребляемые в практике микробиологии основные и кислые красители.

Приготовление мазков для окрашивания. Мазки для микроскопии готовят из культур микробов с твердых и жидких питательных сред, клинического материала (мокроты, гноя, крови, осадка мочи, смЖ и пр.), из биоптатов, органов трупов. Техника приготовления мазков определяется физическими свойствами исследуемого материала.

1. Мазки из микробных культур с жидких питательных сред и жидкого патологического материала. Маленькую каплю исследуемой жидкости наносят на предметное стекло бактериологической петлей и круговыми движениями последней распределяют равномерным слоем в виде кружка диаметром 8-10 мм. Мазки должны содержать достаточно материала для полноценно исследования, но не должны быть чрезмерно толстыми, так как содержащиеся в них клетки невозможно будет дифференцировать.

2. Мазки с плотных питательных сред. На середину чистого, хорошо обезжиренного предметного стекла наносят каплю водопроводной воды. В нее вносят бактериологической петлей небольшое количество исследуемой микробной культуры, чтобы капля воды стала слегка мутной. После этого излишек микробного материала на петле сжигают в пламени газовой горелки и приступают к изготовлению мазка по способу, описанному выше.

3. Мазки крови. На хорошо обезжиренное и свершено сухое предметное стекло наносят каплю крови, прикасаясь узким концом его непосредственно к уколу на пальце. Стекло держат большим и указательным пальцами левой руки каплей кверху. Второе шлифованное стекло, которое должно быть уже предметного, правой рукой ставят на первое под углом 40-45 ° и подводят к капле крови до соприкосновения с ней. После того как кровь растечется по шлифованному краю, стеклом делают скользящее движение справа налево, равномерно распределяя кровь тонким слоем по всей поверхности стекла.

Толщина мазка зависит от величины угла между стеклами: чем острее угол, тем тоньше мазок. Правильно приготовленный мазок имеет светло-розовую окраску и одинаковую толщину на всем своем протяжении.

Приготовление толстой капли На середину хорошо обезжиренного сухого предметного стекла наносят каплю крови пастеровской пипеткой или непосредственно из места прокола пальца. Нанесенную на предметное стекло каплю крови размазывают бактериологической петлей до размера 8-10 мм в диаметре. Кровь в толстой кайле распределяется неравномерно, образуя неровный край. Предметное стекло с мазком оставляют в горизонтальном положении до высыхания крови.

4. Мазки из слизистого отделяемого полости рта, носа, носоглотки и влагалища. Мазки с тампонов готовят путем прокатывания последних по предметному стеклу. Этот метод помогает сохранить морфологию и расположение клеток хозяина на участке, с которого получен материал.

5. Мазки из вязкого материала (мокрота, гной). При изготовлении мазков из мокроты исследуемый материал выливают в чашку Петри и выбирают из него частицы, содержащие гнойные комочки, в которых с наибольшей вероятностью могут быть обнаружены возбудители болезни. Мокроту или гной переносят на предметное стекло, ближе к одному из узких его краев, и накрывают другим предметным стеклом. Стекла слегка придавливают друг к другу, а затем свободные от исследуемого материала концы стекол захватывают большими и указательными пальцами обеих рук и разводят в противоположные стороны.

При движении оба стекла должны плотно прилегать друг к другу. При таком способе приготовления мазка исследуемый материал, занимающий большую часть предметного стекла, распределяется тонким равномерным слоем.

6. Мазки из биоптатов и трупного материала. Поверхность исследуемого органа (биоптата или трупного материала) прожигают накаленными браншами пинцета с целью ее обеззараживания. По прокаленному месту делают разрез и затем из глубины ткани остроконечными ножницами вырезают небольшой кусочек. Если он мягкий, имеет рыхлую консистенцию, его помещают между двумя предметными стеклами и поступают так же, как при изготовлении мазка из гноя или мокроты. Если ткань органа плотная, то в глубине надреза скальпелем делают несколько как можно более тонких соскобов. Полученный материал распределяют по поверхности предметного стекла бактериологической петлей или скальпелем.

Для изучения взаимного расположения элементов ткани и находящихся в них микроорганизмов делают мазки-отпечатки. Для этого небольшой кусочек ткани, вырезанный из середины органа, захватывают браншами пинцета и прикладывают к предметному стеклу последовательно несколько раз, получая таким образом ряд мазков-отпечатков.

7. Высушивание и фиксирование мазков. Приготовленные на предметном стекле мазки высушивают на воздухе и после полного их высыхания фиксируют. Лучше всего сушить препарат на воздухе. Правильно приготовленный тонкий мазок высыхает в течение нескольких минут.

За высушиванием следует процесс фиксации мазка, который преследует несколько целей:
— убить содержащиеся в мазке микроорганизмы, снизив таким образом опасность обращения с препаратом, однако при этом всегда надо помнить, что ни один метод фиксации не гарантирует уничтожение всех находящихся в мазке микроорганизмов;
— зафиксировать на поверхности стекла содержащиеся в мазке микробные клетки, чтобы при последующей окраске и промывке препарата они не соскальзывали со стекла;
— повысить восприимчивость к окраске, так как убитые микробные клетки окрашиваются значительно лучше живых.

Различают физический и химический способы фиксации. Физический способ основан на воздействии высокой температуры на микробную клетку, химический — на применении химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы.

- Физический способ фиксации. Предметное стекло берут за ребра со стороны узкого края пинцетом или большим и указательным пальцами правой руки таким образом, чтобы мазок находился на верхней поверхности стекла. Плавными движениями руки предметное стекло проносят 2-3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации занимает не более 2-3 с. Для проверки надежности фиксации свободную от мазка поверхность предметного стекла прикладывают к тыльной стороне левой кисти. При правильном фиксировании стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога.

- Химический способ фиксации. Для фиксации мазков применяют химические вещества или их соединения. Существуют два метода химической фиксации мазков: 1) предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксатором, затем высушивают на воздухе и микроскопируют; 2) на горизонтально установленные предметные стекла с мазками наносят по капле фиксатор и дают высохнуть. Время фиксации зависит от применяемых в качестве фиксаторов веществ.

Кроме приведенных в таблице веществ, для фиксации мазков применяется 40% коммерческий формалин. На дно чашки Петри наливают 4-5 мл формалина, а к крышке чашки прикрепляют предметное стекло мазком кнаружи. Фиксацию проводят парами формалина при слабом подогревании на водяной бане в течение 10 мин.

- Читать далее "Простые методы окраски мазков"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 13.05.2019