Основным методом лабораторного подтверждения диагноза коклюша, его золотым стандартом является выделение и идентификация возбудителя. Выделение возбудителя у больных коклюшем в результате бактериологического исследования, проведенного в идеальных условиях (первые дни болезни, правильное взятие материала, хорошие питательные среды и т.д.), составляет 80%. В клинической практике оно, как правило, не превышает 10% случаев, редко 20%. Невысокая высеваемость микроорганизмов рода Bordetella обусловлена их сниженной выживаемостью во внешней среде, поздним обследованием больных, низким качеством питательных сред, применением антибиотиков до начала бактериологического обследования, медленным ростом, контаминацией исследуемого материала другими микроорганизмами, недостаточной кратностью обследования, неправильным взятием исследуемого материала.

а) Показания к лабораторному исследованию. Бактериологические исследования проводят с диагностической целью и по эпидемическим показаниям.

С диагностической целью для подтверждения или установления диагноза обследованию подлежат:

- дети с подозрением на коклюш и коклюшеподобные заболевания по клиническим показаниям;

- дети, кашляющие в течение 5-7 дней и более, независимо от указаний на контакт с больным коклюшем или паракоклюшем;

- взрослые с подозрением на коклюш и коклюшеподобные заболевания, работающие в родильных домах, детских больницах, санаториях, детских дошкольных учреждениях и школах, а также в закрытых детских учреждениях.

Обследование с диагностической целью должно проводиться двукратно, ежедневно или через день на 1-3-й неделях болезни. При обследовании в более поздние сроки высеваемость возбудителя резко снижается. Ответственным за своевременное направление больных на бактериологическое обследование является участковый врач.

Обследованию по эпидемическим показаниям подлежат лица, общавшиеся с больным коклюшем:

- дети, посещавшие дошкольные детские учреждения, находящиеся в больницах, санаториях, закрытых детских учреждениях, а также дети до 14 лет, общавшиеся с больными коклюшем или коклюшеподобным заболеванием в домашних условиях;

- взрослые, работающие в вышеуказанных детских учреждениях и общавшиеся с больным коклюшем или коклюшеподобным заболеванием в домашних условиях.

Необходимость проведения бактериологического обследования в детских учреждениях и других организованных коллективах и его сроки устанавливает эпидемиолог.

б) Сбор материала. При бактериологической диагностике производится посев исследуемого материала на оптимальные питательные среды и выделение чистой культуры с последующей идентификацией возбудителя. Исследуемым материалом является слизь из верхних дыхательных путей, оседающая при кашле на задней стенке глотки. Взятие материла из зева для бактериологического исследования на коклюш должны осуществлять медицинские работники (врач, фельдшер, медицинская сестра, лаборант) после соответствующего инструктажа. Материал берут в детских поликлиниках в специально выделенном помещении, исключающем контакт с другими детьми, а также в детских учреждениях и на дому. При взятии материала должна быть полностью исключена возможность взаимного заражения обследуемых. Материал берут натощак или через 2-3 ч после еды, а также до применения полоскания или других видов лечения.

Взятие материала осуществляется двумя способами — заднеглоточным тампоном и кашлевыми пластинками. Заднеглоточным тампоном материал берут как с диагностической целью, так и по эпидпоказаниям. Метод кашлевых пластинок используют только с диагностической целью при наличии кашля. У детей грудного возраста рекомендуется брать материал заднеглоточным тампоном.

Для увеличения числа положительных результатов взятие материала проводят двумя видами ватных тампонов — стерильным сухим или «увлажненным» (забуференным физиологическим раствором), предварительно, до стерилизации, изогнутыми под тупым углом. Взятие материала сухим тампоном стимулирует кашель, а «увлажненным» — повышает возможность последующего выделения возбудителя.

в) Методика взятия материла. Голову ребенка фиксируют, после чего под контролем шпателя фиксируют корень языка и вводят тампон в полость рта, продвигая его за корень языка. Тампон не должен касаться слизистой щек, языка и миндалин. Кончиком тампона, выпуклой его частью, касаются задней стенки глотки, делая 2-3 мазка. Затем тампон осторожно извлекают из полости рта. Материал, взятый сухим тампоном, немедленно засевают на одну из рекомендуемых питательных сред, а взятый «увлажненным» тампоном — доставляют в лабораторию для посева не позднее 2-4 ч после взятия материала. Взятие материла кашлевыми пластинками, кроме медицинского персонала, можно поручить родителям после их инструктажа. Сбор материала производят на 2 чашки с питательной средой. Во время приступа кашля левой рукой снимают крышку чашки, а правой рукой подносят ее ко рту на расстоянии 10-12 см так, чтобы капельки слизи из дыхательных путей попали на поверхность среды. Чашку в таком положении держат в течение 6-8 кашлевых толчков. На питательную среду не должны попадать слюна, рвотные массы, мокрота. Затем чашку со средой закрывают и доставляют в лабораторию.

При посеве материала с диагностической целью рекомендуется использовать 2 чашки, по эпидемическим показаниям — 1 чашку.

При транспортировке необходимо учитывать плохую выживаемость возбудителя коклюша в окружающей среде, поэтому посевы помещают в специальные контейнеры с защищающими прокладками, оберегая от прямых солнечных лучей и сохраняя в температурных пределах 4-37°С.

г) Ход исследования:

1. Первый день исследования. Посев материала производят последовательно на 1-2 чашки с питательной средой, предварительно обработанной антибиотиком для подавления роста посторонней микрофлоры, согласно инструкции. Для получения изолированных колоний материал тщательно втирают тампоном вначале по периферии среды чашки Петри в виде 4-5 площадок, а затем Z-образным штрихом в центре чашки. Стерильным шпателем растирают центральные части посева, не касаясь площадок.

Чашки, засеянные тампоном или кашлевые пластинки, помещают в термостат при температуре 35-37°С на 3 сут. (72 ч). Для увлажнения воздуха в термостат ставят сосуд с водой.

В качестве питательной среды для посева исследуемого материала применяют среду Борде-Жангу или казеиново-угольный агар (КУА) без добавления крови. Среды могут быть приготовлены в лабораториях или приобретены на коммерческих предприятиях.

2. Четвертый день исследования (3 сут., 72 ч). Просматривают посевы на чашках с питательной средой с целью отбора колоний микробов, подозрительных в отношении рода Bordetella. Просмотр колоний производят при помощи бинокулярного стереоскопического микроскопа (МБС-1, МБС-2, МБС-3) или бинокулярной лупы с большим фокусным расстоянием (см. в разделе «Морфологические, культуральные, биохимические и прочие физиологические свойства»).

Сроки появления колоний различны: B.bronchiseptica — через 18-24 ч, В.parapertussis — через 24-48 ч и B.pertussis — через 48-72 ч. Различная скорость роста отражается и на величине колоний. На средах с кровью вокруг колоний образуется зона слабого гемолиза. Рос т B.bronchiseptica и B.pertussis на питательной среде не сопровождается изменением ее цвета, в то время как B.parapertussis при обильном росте на КУА вызывает окрашивание среды в буроватый цвет. Культуральные особенности разных микроорганизмов рода Bordetella подробно описаны выше.

При наличии на среде подозрительных колоний производят выделение чистой культуры путем отсева их на чашки с одной их питательных сред. При этом поверхность среды делят на несколько секторов и отсевают каждую колонию на отдельный сектор, тщательно втирая ее в среду круговыми движениями.

При наличии значительного количества однотипных подозрительных колоний, помимо выделения чистой культуры, из оставшихся колоний делают мазки в физиологическом растворе, определяя морфологию культуры при окраске по Граму и отсутствии спонтанной агглютинации. Культуру проверяют в реакции агглютинации на стекле со специфическими неадсорбированными сыворотками, разведенными 1:10 и но возможности с адсорбированными сыворотками к факторам 1 и 14. Если число подозрительных колоний значительно, то возможна постановка пробы Заксе для определения наличия фермента уреазы.

На основании изучения характера колоний и морфологии клеток, положительной агглютинации с видовыми неадсорбированными и адсорбированными сыворотками к факторам 1 и 14 через трое суток можно выдать предварительный ответ.

При отсутствии роста подозрительных колоний на среде выращивания чашки Петри вновь помещают в термостат на 24-48 ч и просматривают повторно в соответствующие сроки.

3. Пятый-шестой день исследования (4-5 сут., 96-120 ч). Посматривают посевы, произведенные для выделения чистой культуры и отмечают изменение цвета среды (побурение при росте B.parapertussis).

На предметном стекле в кайле физиологического раствора (NaCl) готовят мазки и окрашивают их но Граму, определяя морфологию выделенной культуры, ее чистоту и отсутствие спонтанной агглютинации.

Серологические свойства проверяют в реакции агглютинации на стекле со специфическими неадсорбированными коклюшными и паракоклюшными сыворотками, разведенными 1:10, а также с адсорбированными монорецепторными сыворотками к факторам 1 и 14. Серотип коклюшного микроба определяют с монорецепторными сыворотками к антигенам (факторам) 1, 2 и 3.

Для проверки биохимических свойств производят посевы чистой культуры на агаровую среду с тирозином (определение наличия тирозиназы), определяют наличие уреазы в пробе Заксе или посевом на бульон с мочевиной. При подозрении на выделение В. bronchiseptica определяют утилизацию цитрата на среде Симмонса и подвижность путем посева на 0,5%-ный полужидкий агар.

На основании изучения чистой культуры: морфологии колоний и клеток, реакции агглютинации с неадсорбированными сыворотками и адсорбированными монорецепторными сыворотками к факторам 1 и 14, результатов пробы на уреазу, изменение цвета среды с тирозином, утилизацию цитратов может быть выдан окончательный ответ.

Если в течение пяти суток (6-й день исследования) на среде выращивания не обнаружены подозрительные для рода Bordetella колонии, наблюдение прекращают и выдают окончательный отрицательный ответ.

д) Определение чувствительности к антибиотикам. Процедура определения чувствительности к антибиотикам не стандартизована и трудоемка, так как требуется преинкубация бактерий в бульоне, последущая инокуляция на агаровые среды и длительная инкубация. Исследования, проводимые в последние 10 лет, показали, что В. pertussis чувствительна к эритромицину in vivo и in vitro. Поэтому рутинное определение чувствительности В. pertussis к антибиотикам не проводится.

- Читать далее "Методы экспресс-диагностики возбудителя коклюша (B. pertussis)"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 19.1.2020