Бактериологическая диагностика гемофильной инфекции (H. influenzae, Hib)

Для подтверждения этиологии заболевания и определения чувствительности выделенного возбудителя к антимикробным препаратам обязательно микробиологическое исследование. Оно состоит из следующих основных этапов:
1) получение и транспортировка клинического материала;
2) предварительное исследование: микроскопия клинического материала;
3) выделение чистой культуры при исследовании спинномозговой жидкости, крови и другого клинического материала;
4) идентификация выделенной культуры.

а) Получение и транспортировка клинического материала. В связи с тем, что гемофильная палочка вызывает широкий спектр инфекций, для микробиологического исследования может направляться различный клинический материал. Наибольшую диагностическую ценность представляют исследования стерильных в норме биологических жидкостей: крови, плевральной, перикардиальной, синовиальной, спинно-мозговой жидкостей (СМЖ). Для доказательства этиологической роли Н. influenzae в инфекции НДП необходимо предупреждение контаминации клинического материала микрофлорой ВДП.

Для этого применяют бронхоальвеолярный лаваж, бронхоскопию с «защищенными» щетками. В рутинной практике при инфекциях нижних дыхательных путей в качестве биоматериала для лабораторной диагностики используют мокроту, посев и учет которой проводят количественным методом. Взятие мазка с надгортанника при эпиглоттите имеет ограниченную диагностическую значимость и может представлять угрозу для жизни пациента (риск развития ларингоспазма). Не всегда целесообразно также микробиологическое исследование назофарингеальных мазков в связи с высокой частотой носительства Н. influenzae здоровыми детьми и взрослыми. В связи с низкой жизнеспособностью микроба во внешней среде рекомендуется использовать транспортные среды, например, полужидкий агар Эймиса с углем, и в течение 2 ч (не позднее) доставлять материал в лабораторию. СМЖ необходимо исследовать немедленно или хранить при 35-37°С не более 30 мин (не ставить в холодильник!).

б) Предварительное исследование: микроскопия клинического материала. Предварительным этапом, предшествующим непосредственному выделению бактерий, является исследование мазков клинического материала, окрашенных по Граму и/или метиленовым синим. 11ри окраске по Граму бактерии рода Haemophilus представляют собой мелкие, бледно окрашенные сафранином или фуксином грамотрицательные палочки, обладающие полиморфизмом, иногда образующие длинные нити. При окраске метиленовым синим гемофилыгые палочки имеют синий цвет на серо-голубом фоне. Отрицательный результат микроскопии не исключает возможности гемофильной инфекции, гак как в клиническом материале может присутствовать недостаточное количество микробов. Поэтому обязательно культуральное бактериологическое исследование, которое остается золотым стандартом микробиологической диагностики.

При исследовании материалов, содержащих микробные ассоциации (мокрота, материал из среднего уха, пазух носа), следует провести микроскопическое исследование мазка. Критерием пригодности мокроты для посева является наличие более 25 сегментоядерных лейкоцитов и не более 10 эпителиальных клеток в поле зрения при просмотре 20 полей зрения мазка, окрашенного по Граму (при увеличении х100).

в) Бактериологическое исследование (при исследовании СМЖ, крови и другого клинического материала). Как отмечено выше, поступившую для анализа СМЖ необходимо исследовать немедленно. Для увеличения концентрации микроорганизмов рекомендуется центрифугировать не менее 1 мл образца СМЖ 5-15 мин при 1,5-3 тыс. об/мин. Надосадок асептически переносят в стерильную пробирку, а осадок перемешивают многократным пипетированием и проводят посев нескольких капель осадка СМЖ на поверхность чашек с кровяным «шоколадным», сывороточным агаром и на двухфазную среду (ДФС) (см. 32.2.2.18). Существуют коммерческие готовые чашки Петри с «шоколадным» агаром (bioMerieux, BBL) и добавки ростовых факторов: PolyVitex (bioMerieux), IsoVitalex (BBL), Supplement В (Difco Laboratories).

Недостатком «шоколадного» агара является невозможность изучить гемолитические свойства, которые позволили бы отдифференцировать Н. haemolyticus и Н. parahaemolyticus от Н. influenzae и Н. parainfluenzae.

Другие биологические жидкости (синовиальную, перикардиальную, плевральную) исследуют в мазках, окрашенных по [раму, и культурально. Образцы крови помещают в ДФС и инкубируют 18-24 ч. При отсутствии помутнения в жидкой фазе рекомендуется через 6-12 ч проводить «слепое» субкультивирование на «шоколадном» агаре и микроскопию окрашиванного мазка из предварительно перемешанной жидкой фазы. При этом инкубация флакона продолжается.

Через 24 ч инкубации, независимо от мутности бульона, следует приготовить мазок. При наличии мутности бульона или положительной находке в мазке необходимо сразу сделать высев на сывороточный и «шоколадный» агар.

Для посева контаминированных образцов желательно использовать селективный агар или «шоколадный» агар с бацитрациновым диском. В качестве селективного используют «шоколадный» агар с добавлением бацитрацина, так как высокая концентрация этого антибиотика (300 мкг/мл) подавляет рост большинства других микроорганизмов (стафилококков, микрококков, стрептококков), что позволяет получить рост гемофильной палочки при сильно контаминированном клиническом материале. Можно использовать также диски с бацитрацином (10 ЕД), которые помещают после посева на «шоколадный» агар, поскольку устойчивые к бацитрацину гемофилы будут расти вокруг диска. Кроме плотных питательных сред, используют жидкие среды, в частности «шоколадный» бульон.

Оптимальными условиями инкубации для Н. influenzae является влажная атмосфера с повышенным содержанием диоксида углерода (CO2; 5-10%) и температура 35-37°С. Такие условия могут быть созданы в CO2-термостате или при инкубации чашек в эксикаторе с зажженной свечой (в результате горения свечи уменьшается концентрация кислорода и повышается содержание CO2). Длительность инкубации — 18-24 ч. После инкубации в течение 24 ч колонии выделенной культуры Н. influenzae на «шоколадном» агаре могут выглядеть следующим образом:

- капсульные штаммы образуют слизистые круглые сочные колонии сероватого цвета в диаметре до 2 мм, дающие радужную окраску в проходящем свете (иридиирующие);

- штаммы со слабовыраженной капсулой дают полупрозрачные круглые гладкие неиридиирующие колонии;

- бескапсульные штаммы образуют мелкие непрозрачные неиридиирующие колонии с неровными краями.

Для чистой культуры гемофильных бактерий характерно наличие специфического «мышиного» запаха.

1. Идентификация выделенной культуры. Для накопления биомассы, необходимой при идентификации культуры, подозрительные колонии отсевают «сектором» на чашки с «шоколадным» агаром или пробирки со скошенным «шоколадным» агаром. Из оставшейся части колонии делают мазки и окрашивают их по Граму. При просмотре мазков определяются мелкие грамотрицательные палочки; для бескапсульных штаммов характерен полиморфизм, проявляющийся в образовании нитевидных форм.

Дальнейший анализ проводится в соответствии со схемой, приведенной ниже, в которой этап накопления биомассы и приготовления мазка соответствует второму дню микробиологического исследования.

2. Схема микробиологического исследования. Первый день. Прямая микроскопия окрашенного мазка клинического материала. Первичный посев клинического материала (на «шоколадный», сывороточный агар, ДФС). При необходимости (в СМЖ) определение Hib-антигена в реакции латекс-агглютинации.

Второй день. Отбор подозрительных колоний, их изучение и пересев на чашку Петри с «шоколадным» агаром «сектором» или скошенный «шоколадный» агар. Микроскопия окрашенного мазка из колонии.

Третий день. Определение каталазной активности. Определение цитохромоксидазной активности. Посев на чашку для определения потребности в факторах X и V (или с тест-стрипами). Определение β-галактозидазной активности (предварительный учет). Определение чувствительности к ампициллину и другим антибактериальным препаратам на среде НТМ. Выявление β-лактамазы (тест с нитроцефином).

Четвертый день. Учет потребности в факторах X и V. Учет р-галактозидазной активности.

Учет результатов определения чувствительности на среде НТМ. Определение серотипа выделенной культуры Н. influenzae в реакции агглютинации (в соответствии с «Наставлением» по применению типовых антисывороток).

Ответ о наличии Н. influenzae или другого вида Haemophilus выдается при идентификации капсульного типа Н. influenzae с учетом результатов чувствительности к ампициллину и другим антибактериальным препаратам.

При необходимости биотипирования выделенного штамма производятся постановка пробы на индолообразование, определение наличия уреазы, определение наличия орнитиндекарбоксилазы..

Пятый день. Учет результатов биотипирования Н. influenzae.

3. Определение чувствительности к антибиотикам. Потенциальной активностью в отношении Н. influenzae обладают следующие антибиотики: аминопенициллины, ингибиторозащищенные пенициллины, цефалоспорины II—IV поколений, тетрациклины, фторхинолоны и др. В соответствии с международными и национальными рекомендациями, для выявления ампициллинорезистентности у гемофильной палочки в лабораторной практике достаточно определить чувствительность к ампициллину дискодиффузионным методом и провести тест на продукцию β-лактамаз с нитроцефином. Эти два теста позволяют подразделить штаммы Н. influenzae на ампициллиночувствительные, β-лактамазопродуцирующие ампициллинорезистентные (чувствительные к ингибиторозащищенным пенициллинам и цефалоспоринам II—IV поколений) и БЛНАР-штаммы, которые следует расценивать как резистентные к ингибиторозащищенным пенициллинам и некоторым цефалоспоринам.

По причине особой прихотливости патогенных гемофилов определение чувствительности к антибиотикам в нестандартных условиях может приводить к получению неточных результатов. В нашей стране определение чувствительности гемофилов к антибиотикам рекомендуется проводить дискодиффузионным методом с использованием стандартов Национального комитета по клиническим лабораторным стандартам США (NCCLS). Следует пользоваться только средой НТМ (Haemophilus Test Medium, англ.) — средой для тестирования гемофилов. Среда АГВ, применяемая в России для определения чувствительности к антибиотикам, с добавками и «шоколадно»-кровяной агар на основе АГВ для гемофилов непригодны. Для испытания используют суспензию суточной культуры, соответствующую стандарту мутности 0,5 но Мак-Фарланду (1,5x10,8 КОЕ/мл).

Чашки с посевами и нанесенными на них дисками с антибиотиками инкубируют в течение 16-18 ч при 35°С в атмосфере с 5-7% CO2. Определяют чувствительность к ампициллину, амоксициллин/клавулонату, хлорамфениколу, тетрациклину, ципрофлоксацину или левофлоксацину, цефогаксиму или цефтриаксону, меропенему, ко-тримоксазолу, азитромицину.

- Читать далее "Методы экспресс-диагностики гемофильной инфекции (H. influenzae, Hib)"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 24.1.2020

Остались вопросы или замечания?

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.