Исследуемый материал. При подозрении на респираторный микоплазмоз исследуют мазки из носоглотки, лаважную жидкость, мокроту, мазки-отпечатки тканей органов мертворожденных и абортированных плодов, сыворотку крови. При урогенитальных инфекциях исследуют центрифугат срединной порции утренней мочи, соскобы со слизистой уретры, сводов влагалища, цервикального канала, материал, полученный при лапароскопии, амниоцентезе, мазки-отпечатки тканей органов абортированных и мертворожденных плодов. При простатите предметом исследования является секрет простаты, при бесплодии у мужчин — сперма.

При взятии материала из урогенитального тракта предварительно ватным тампоном удаляют слизь. Соскоб должен содержать большое количество клеток.

а) Культуральные методы. Микоплазмы чрезвычайно требовательны к составу питательных сред и условиям культивирования. Питательные среды должны содержать все предшественники, необходимые для синтеза макромолекул, источники энергии: глюкозу (для видов, ферментирующих ее), аргинин (для видов, не ферментирующих глюкозу), мочевину (для уреаплазм), холестерин, жирные кислоты и фосфолипиды. Источником всех последних соединений является сыворотка крови животных, для большинства микоплазм — сыворотка крови лошади. Многие виды микоплазм лучше растут в атмосфере газовой смеси, состоящей из 95% N и 8% CO₂.

Микоплазмы можно культивировать на жидких, полужидких (0,3% агара) и полутвердых (1,3% агара) питательных средах, Мр — на стекле и пластике как культуру клеток. Большинство видов микоплазм растет медленно, культивирование Мр и Mg продолжается несколько дней или даже несколько недель, Mh в бульоне достигает конца логарифмической фазы роста через 48-72 ч, на агаре колонии формируются через 2-5 сут. Uu имеет очень короткую стационарную фазу, жизнеспособность клеток резко падает уже через 24 ч, реже через 48 ч, к этому времени в плохо забуференной среде погибает приблизительно 90% клеток.

Бульонные культуры микоплазм слегка опалесцируют, уреаплазмы не вызывают помутнения среды даже при густоте 10⁷ КОЕ/мл. В толще полужидкого агара микоплазмы и уреаплазмы образуют светлое облачко по ходу укола пипетки, заметное в проходящем свете.

На полутвердом агаре микоплазмы образуют нежные равномерно-зернистые колонии 0,1-0,3 мм в диаметре с плотным центром, они похожи на яичницу-глазуныо. Колонии уреаплазм еще меньше. Чашки просматривают под микроскопом при малом увеличении.

Прописи сред приведены в отдельных статьях на сайте.

При посеве образцов клинического материала необходимо внести этот материал в транспортную среду. Последняя представляет собой бульон, используемый для культивирования микоплазм, без сыворотки и источников энергии (глюкоза, аргинин, мочевина), но содержащий пенициллин в концентрации 10 000 ЕД/мл и амфотерицин — 5 ЕД/мл в качестве ингибиторов посторонней флоры. В этой среде материал выдерживают 30 мин при комнатной температуре, после чего делают пересев в среды культивирования и дифференциальной диагностики.

Дальнейшие пересевы производятся на среды, содержащие пенициллин, благодаря которому рост посторонней флоры подавляется.

Рост М. pneumoniae при выделении от больного учитывают через 2-3 нед., рост лабораторных культур микоплазм — через 4-5 сут. Показателем роста является изменение цвета сред с индикаторами.

Выделенные чистые культуры микоплазм идентифицируют при помощи серологических методов, для чего необходимо иметь набор видоспецифических иммунных сывороток, либо при помощи ПЦР.

Видовая идентификация микоплазм — трудоемкая и дорогостоящая процедура. В диагностических целях, как правило, достаточно использовать специальные среды с индикатором и различными субстратами (аргинин или глюкоза либо мочевина), ферментируемыми разными видами микоплазм и уреаплазм.

Достоинством культуральных методов является возможность получения чистой культуры для испытания чувствительности к антибиотикам. Недостатки метода — длительность культивирования, трудности выделения некоторых штаммов, наличие «некультивируемых форм» микоплазм, неспособность расти в отсутствии живых клеток.

Определение чувствительности к антибиотикам выделенных штаммов проводят обычно в бульоне, используемом для идентификации чистых культур. О подавлении роста антибиотиком судят по отсутствию изменения цвета индикатора, находящегося в среде. Реакции по определению чувствительности можно проводить микрометодом в полистироловых планшетах или использовать для этой цели готовые коммерческие тест-системы.

б) Выявление антигенов микоплазм в образцах клинического материала. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ). Материалом для исследования служат мазки-отпечатки тканей, соскобы из уретры, секрет простаты, сперма, центрифугат мочи и лаважной жидкости, мазки синовиальной жидкости. Для обнаружения антигенов Mh и Uu методом прямой иммунофлюоресценции используют препараты отечественного производства МикогомоФлюоСкрин и УреагениФлюоСкрин (НИАРМЕДИК ПЛЮС набазе НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва), снабженные соответствующими инструкциями, а также Мико Слайд и Уреа Слайд производства АО «Лабдиагностика» (Москва).

Соскобы слизистых оболочек уретры и шейки матки берут одноразовыми стерильными зондами, «щеточками», ложкой Фолькмана, соблюдая правила асептики и антисептики. Предварительно удаляют слизь тампонами или при помощи аспиратов. Соскобы берут с задней стенки влагалища, из глубины канала шейки матки после удаления слизистой пробки, из уретры. В материале должно быть максимально возможное количество клеток и минимальное количество слизи. Из соскобов делают мазки на предметных стеклах.

Стекла с мазками высушивают на воздухе, фиксируют в 96%-ном спирте или холодном метаноле 15 мин. Фиксированные мазки можно хранить несколько дней при +4°С.

Препараты, согласно инструкции, окрашивают меченой иммунной сывороткой, промывают водопроводной водой 15 мин, высушивают и просматривают в люминесцентном микроскопе с водной либо масляной иммерсией.

В качестве флюоресцентной метки используют ФИТЦ (флюоресцеинизотиоционат); микоплазмы и уреаплазмы окрашиваются в зеленый цвет. Зеленые гранулы располагаются на поверхности клеток и в межклеточных пространствах. Цитоплазма клеток окрашивается голубым Эванса в красно-бурый цвет. Препараты просматривают в люминесцентном микроскопе.

Результат считается положительным, если в препарате обнаруживают не менее 10 зеленых светящихся гранул.

Метод обладает высокой специфичностью и чувствительностью и применим для выявления микоплазм в любом клиническом материале.

Антигены микоплазм могут быть обнаружены также в клиническом материале (в крови) при помощи иммуноферментного анализа (ИФА). К сожалению, этот метод доступен только лабораториям, имеющим специфические гипериммунные антисыворотки.

в) Серодиагностика. Антитела к микоплазмам выявляют при помощи различных серологических реакций: ингибиции роста (РИР), ингибиции метаболизма (РИМ), микоплазмоцидного теста, РСК и др. Однако для постановки этих реакций необходимо иметь живые культуры микоплазм, что невозможно для большинства клинических лабораторий. Поэтому в последние годы чаще всего для выявления антител используют ИФА и реакцию непрямой гемагглютинации (РИГА). Материалом для исследования служит сыворотка крови больного.

При респираторном микоплазмозе путем ИФА могут быть выявлены IgM на 7-й день после появления первых симптомов заболевания, а их пик отмечается через 2-3 нед. IgM не продуцируются при реинфекции, поэтому их наличие свидетельствует о недавней инфекции, и при обследовании детей раннего возраста достаточно иметь единственную пробу сыворотки. Вместе с тем есть данные, что в ИФА можно обнаружить IgM и через 6-8 мес., поэтому при исследовании одной пробы сыворотки не всегда возможно точно датировать заболевание. При исследовании парных проб сыворотки первая должна быть получена как можно раньше.

1. Иммуноферментный анализ (ИФА). Существуют коммерческие тест-системы для выявления IgM и IgG в ИФА к Мр (фирмы «Sanofi diagnostics Pasteur»), Mycoplasma pneumoniae IgG и IgM kits (Qualitative Enzyme Immunoassay indirect фирмы «Sigma») и препараты для выявления антител к Mh и Мр (Мико-гомоСкрин и МикопневмоСкрин производства НИАРМЕДИК ПЛЮС при НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (Москва), Вектор-Бест (Mh). Методика постановки реакции, ее учета и трактовки результатов изложены в инструкциях к препаратам.

При урогенитальных микоплазменных инфекциях выявление антител имеет меньшую диагностическую ценность, чем выявление антигенов или выделение возбудителей культуральным методом, так как инфекция, как правило, имеет хроническое течение, а «урогенитальные» микоплазмы являются слабыми антигенными раздражителями. Тем не менее при этой инфекции в ряде случаев необходимо проводить исследование на наличие антител.

2. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). Для постановки реакции используют стабилизированные и активированные глутаровым альдегидом эритроциты человека, имеющего O(I) группу крови, резус-отрицательные, сенсибилизированные растворимым антигеном микоплазм. Последний представляет собой центрифугат ультразвукового дезинтеграта биомассы микоплазм (2х10⁸ КОЕ/мл), для сенсибилизации используют раствор антигена в изотоническом растворе натрия хлорида, содержащий белок (2 мг/мл).

Методика постановки реакции и ее учета изложена в специальных руководствах.

Диагностическое значение имеет увеличение в 4 раза титра антител в парных пробах сыворотки крови пациента. При отсутствии парных проб диагностическое значение имеет титр 1:32.

г) Молекулярно-биологические методы диагностики. Методы основаны на идентификации ДНК и РНК, специфичных для данного микроорганизма, и включают гибридизацию на основе ДНК-зондов и диагностику на основе ПЦР. Первый метод позволяет идентифицировать любые виды микоплазм при наличии 10⁴—10⁵ КОЕ в пробе. Для метки ДНК-зондов используют радиоактивный фосфор либо лиганд, который распознается специфическими антителами, конъюгированными с пероксидазой или щелочной фосфатазой.

Материалом для исследований служат соскобы из урогенитального тракта, носоглотки, лаважная жидкость, моча. Пробы помещают в буферный физиологический раствор.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) основана на амплификации in vitro видоспецифического фрагмента ДНК исследуемой микоплазмы любого вида с последующей его идентификацией. Теоретически метод позволяет выявлять единичные клетки микоплазм.

Для реакции амплификации берут 25-50 мкл среды. Среда, используемая для реакции, содержит 60 ммоль трис-НС1 (pH 8,8); 16,6 ммоль сульфата аммония (NH₄)₂SO₄ 1,5 ммоль хлорида магния MgCl₂; 10 ммоль каждого из четырех дезоксирибонуклеотидов — трифосфатов; по 12 ммоль каждого праймера; ДНК-мишень (до 1 мкл) и 2 единицы Taq-полимеразы.

Для проведения ПЦР используют амплификатор. Программа амплификации включает 30-35 циклов в следующем режиме: денатурация при температуре 96°С в течение 1 мин, отжиг праймеров при температуре 45-65°С (величина рассчитывается теоретически, что соответствует температуре плавления используемых праймеров) в течение 0,5 мин, синтез при температуре 72°C в течение 2 мин. Продукты амплификации выявляют после электрофореза в 1,2% агарозном геле, окрашенном этидиумбромидом. Наличие фрагмента ДНК с заданным показателем учитывается как положительный результат.

Амилификон выявляют также путем гибридизации продуктов амплификации с биотилированным или меченным реактивным изотопом олигонуклеотидом, комплементарным последовательности ДНК, расположенной внутри амплифицированного фрагмента. Гибридизацию проводят на фильтрах или в микропланшетах. Последнее дает возможность количественно оценивать результаты. Для постановки ПЦР различные отечественные фирмы предлагают тест-системы (ФГУНЦНИЭ Роспотребнадзора, «Литех», «ДНК-технология», «Синитол» и др.).

Для респираторного микоплазмоза наиболее информативными являются РИФ и ПЦР, а также исследование парных проб сыворотки крови в ИФА либо РИГА. Для диагностики урогенитальных микоплазменных инфекций наиболее информативны культуральный метод, РИФ и ПЦР. Достоинства и недостатки описанных выше методов приведены в таблице выше.

- Читать далее "Тесты на окислительно-восстановительные ферменты для идентификации бактерий"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 21.2.2020