Изучение культур, подозреваемых в причастности к возникновению болезни, начинают с изучения комплекса фенотипических признаков. Результаты исследования фенотипических свойств выделенного микроорганизма служат базой для его родовой и видовой идентификации, а также для решения основного вопроса: играет ли данный микроорганизм этиологическую роль (если он относится к категории патогенных) в диагностируемой инфекции.

В настоящем разделе представлены наиболее часто употребляемые в частной микробиологии биохимические и физиологические тесты, используемые при изучении микроорганизмов, выделяемых от больных с разнообразными инфекциями.

Для определения качества питательных сред и реагентов, используемых для постановки заданного теста, и адекватности полученных результатов видовым признакам испытуемого микроорганизма в реакцию вводят две контрольные культуры, соответствующие положительному и отрицательному результату реакции теста.

Для контроля используют эталонные штаммы микробных культур из национальных микробиологических музеев. Таковыми чаще всего являются коллекционные культуры американского типа — АТСС (American Type Culture Collection, USA), национальные типовые коллекционные культуры (NCTC) Центральной публичной лондонской лаборатории (Central Public Health Laboratory, London, UK), а также штаммы музея патогенных бактерий ФГУН Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля биологических медицинских препаратов им. Л. А. Тарасевича.

В провинциальных городах ввиду отсутствия или затруднений с получением эталонных культур, внесенных в каталоги учреждений, имеющих государственные музеи микробных культур, используют в качестве контрольных штаммы, выделенные в собственной лаборатории, тщательно проверенные и снабженные сопроводительным документом, куда внесены присвоенный им номер, наименование, источник и дата выделения, перечень характерных признаков, имеющих дифференциально-диагностическое значение.

Оксидоредуктазы — класс ферментов, катализирующих окислительно-восстановительные реакции, которые лежат в основе метаболических процессов, обеспечивающих жизнеспособность всех без исключения животных и растительных организмов, в том числе и бактериальных клеток.

Окислительно-восстановительные реакции протекают с участием двух субстратов (окисляемого и восстанавливаемого). Окисление характеризуется отщеплением атомов водорода (протонов) H⁺ или электронов от субстрата-донора, восстановление — присоединением протонов или электронов к субстрату-акцептору. Различают следующие основные оксидоредуктазы: аэробные оксидазы (гидрогеназы), анаэробные дегидрогеназы и цитохромоксидазы.

а) Оксидазные тесты. Оксидазные тесты используют для дифференциации представителей родов Neisseria, Alcaligenes, Aeromonas, Vibrio, Campylobacter, Pseudomonas, обладающих оксидазной активностью, и оксидазоотрицательных Enterobacteriaceae.

Тест основан на том, что у некоторых бактерий биологическое окисление в целях получения энергии осуществляется при помощи цитохромоксидазы либо индофенолоксидазы — железосодержащего белка гемопротеина, который катализирует перенос электронов от вещества-донора (например, НАД-Н) к веществам-рецепиентам (обычно к O₂). Чтобы визуализировать этот процесс, пользуются методами Ковача (Kovacs) или Гэби-Гедли (Gaby-Hadley), основанными на введении в питательную среду искусственных бесцветных реагентов в восстановленном состоянии, которые в присутствии микробной оксидазы окисляются и приобретают соответствующую им окраску.

б) Метод Ковача. Для постановки теста используют 16-18-часовую культуру испытуемого микроорганизма, выращенного в чашках Петри на МПА. Свежеприготовленный реактив Ковача по 1-2 капли наносят пастеровской пипеткой или стерильным дозатором на поверхность изолированных колоний либо несколько миллилитров этого реактива наливают на поверхность среды и, осторожно покачивая чашку, распределяют реактив тонким слоем по всей площади.

При контакте с тетраметил-п-фенилендиамином (реактив Ковача) колонии, продуцирующие цитохромоксидазу, в ближайшие 10-30 с из бесцветных превращаются в темно-фиолетовые вследствие образования окрашенного соединения — вурстеровского синего. Реакцию можно ставить, используя полоски фильтровальной бумаги, пропитанной реактивом Ковача.

в) Метод Гэби-Гедли. В присутствии цитохром-оксидазы N,N-метидил-фенилаланин с альфа-нафтолом (компонентом реактива) образует соединение индофенол синий. Цитохромоксидазные колонии и мазки, приготовленные из них, на фильтровальной бумаге в течение первой минуты окрашиваются в отчетливо синий цвет.

г) Тест на каталазу. Каталаза (греч. katalysis — разрушение) — фермент, способствующий расщеплению перекиси водорода на воду и молекулярный кислород.

2H₂O₂ → 2H₂O + O₂.

Тест на каталазу в практике микробиологических исследований используется очень широко для дифференциации и идентификации ряда патогенных и условно-патогенных бактерий.

Процесс образования каталазы может происходить в широком температурном диапазоне (+15...+40°С) при значениях pH от 4,5 до 9,0. Тем не менее при постановке теста на определение каталазы инкубацию посевов проводят традиционно при 36(±1)°С, а каталазную активность принято определять при исходно нейтральном значении pH в условиях комнатной температуры (+20...+22°С).

Тест основан на том, что с первых же секунд контакта с каталазой перекиси водорода начинается ее расщепление, сопровождающееся более или менее интенсивным выделением пузырьков кислорода.

Техника постановки реакции и умет результатов. Чистую 18-20-часовую культуру идентифицируемого микроорганизма высевают на чашки Петри или в пробирки на питательный агар. Питательные среды, содержащие кровь человека или животных, для постановки каталазного теста не применяются в связи с возможностью получения ложноположительных результатов из-за каталазной активности форменных элементов крови.

Посевы инкубируют при 36(±1)°С не более суток. Для выявления каталазы у выделенных культур предложено 2 способа:

Способ 1. На поверхность выращенной в чашке Петри или пробирке микробной культуры наносят тест-реактив — свежеприготовленный 3%-ный раствор перекиси водорода с таким расчетом, чтобы он тонким слоем покрыл поверхность культуры.

Способ 2. На чистое, хорошо обезжиренное предметное стекло наносят каплю свежеприготовленного 3%-ного раствора перекиси водорода и эмульгируют в ней 1 петлю исследуемой культуры.

При наличии каталазы в микробной культуре на поверхности среды или в капле раствора перекиси водорода на предметном стекле в первые же 2-3 с появляются пузырьки кислорода. Газообразование может быть бурным или умеренным. Независимо от его интенсивности реакция учитывается как положительная. Появление единичных пузырьков или наступление газообразования в более отдаленные сроки (13-15 с) расценивается как реакция сомнительная, требующая повторной постановки. Отсутствие газообразования или появление одиночных пузырьков газа через продолжительное время после добавления реактива определяется как реакция отрицательная.

Контроль положительный: Pseudomonas spp., Proteus spp.

Контроль отрицательный: Streptococcus spp., Clostridium spp.

- Читать далее "Тесты на разложение углеводов для идентификации бактерий"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 21.2.2020