Лабораторная диагностика сыпного тифа и других риккетсиозов включает выделение возбудителя, определение его антигенов и ДНК, выявление антител к риккетсиям соответствующих видов. Чаще осуществляется серологическими (РСК, РНГА, РНИФ, ИФА) и молекулярно-генетическими (ПЦР, определение нуклеотидных последовательностей фрагментов генов) методами.

Выделение возбудителей риккетсиозов от больных наиболее эффективно в острый лихорадочный период, до начала антибиотикотерапии. Основные риккетсиоло-гические методы включают заражение, чаще интраперитонеальное, чувствительных животных (морские свинки, хомячки, хлопковые и белые крысы, белые мыши), развивающихся куриных эмбрионов (в желточный мешок по Коксу), перевиваемых культур клеток (Vero, HeLa, Hep-2, L929), клеток членистоногих.

Животным и в куриные эмбрионы вводят дефибринированную кровь или суспензию растертых в физиологическом растворе сгустков крови, биопсийного материала кожи, а также других тканей больного в зависимости от формы поражений.

При заражении клеточных культур используют плазму, гепаринизированную (или обработанную ЭДТА) кровь, биопсийный материал. Целесообразно выделение возбудителя не только от больного, но и из переносчиков (клещей, блох, вшей).

Эффективно риккетсиологическое обследование снятых с человека переносчиков классическими (выделение возбудителя) и экспресс-методами (метод флюоресцирующих антител, ИФА, РИГА с иммуноглобулиновыми диагностикумами для выявления антигенов риккетсий групп СТ и КПЛ).

Для биопробы используют молодых, весом 300-350 г, морских свинок-самцов. Заражение проводят путем внутрибрюшинного введения 3-5 мл крови или 10%-ных суспензий материалов, содержащих риккетсии (сгустки крови и органы человека и животных, членистоногие). Животным ежедневно измеряют температуру ректально. После инкубационного периода (от нескольких дней до нескольких недель) у морских свинок развиваются различные формы риккетсиозов (лихорадочные, лихорадочно-скротальные, бессимптомные). При заражении R. rickettsii, реже О. tsutsugamushi и С. burnetii у морских свинок может возникать летальная инфекция.

Наиболее характерным проявлением экспериментальных риккетсиозов у морских свинок-самцов при внутрибрюшинном заражении является скротальный феномен — периорхит с накоплением риккетсий во влагалищных оболочках яичка. В ряде случаев может возникать специфический перитонит; риккетсии накапливаются в эндотелиальных клетках кровеносных сосудов различных органов и тканей (тести-кулы, мозг, селезенка, надпочечники). При всех формах инфекционного процесса у биопробных животных выявляют антитела к антигенам риккетсий в различных серологических реакциях (РСК, РНИФ, ИФА) через 2-3 нед. после заражения.

При пассажах штаммов риккетсий на морских свинках наиболее часто используют 10%-ные суспензии мозга и яичек, в ряде случаев также селезенок, надпочечников, реже — печени и почек (Ку-лихорадка, крысиный сыпной тиф). При лихорадке цуцугамуши, крысином и осповидном риккетсиозах, коксиеллезе для изоляции возбудителя можно применять белых мышей. Их заражают внутрибрюшинно 10%-ными суспезиями риккетсиальных материалов в объеме 0,5 мл. Летальность у мышей чаще наблюдается при заражении О. tsutsugamushi, R. akari, реже — R. typhi.

При подкожном заражении морских свинок и белых мышей С. burnetii характерно образование подкожного инфильтрата на месте введения, где накапливаются коксиеллы.

В ряде случаев при экспериментальных риккетсиозах воспроизводят тестикулярные, легочные, перитонеальные и глазные формы инфекционного процесса.

Культивирование в желточных мешках развивающихся куриных эмбрионов более эффективно в отношении накопления риккетсий. Первичное выделение штаммов риккетсий на этой модели проводят редко в связи с высокой вероятностью контаминации посторонней микрофлорой, преимущественно при получений гемокультур.

По результатам овоскопии для заражения отбирают нормально развившиеся куриные эмбрионы с характерным сосудистым рисунком. Заражение проводят со строгим соблюдением правил асептики в специальном стерильном боксе. После дезинфекции спиртом, затем йодной настойкой с последующей обработкой смоченной спиртом поверхности куриного яйца пламенем через пробуравленное в скорлупе отверстие над вершиной воздушной камеры проводят заражение риккетсиальной суспензией в объеме до 0,5 мл проколом в полость желточного мешка. Отверстие в скорлупе заливают расплавленным стерильным парафином. Для контроля на стерильность суспензии для заражения параллельно ее высевают на специальные среды (сахарный бульон, тиогликолевую среду, среды для микоплазмы.

Для культивирования риккетсий группы КПД используют 4-5-суточные эмбрионы, для риккетсий группы сыпного тифа и ориенций — 6-7-суточные, для коксиелл Бернета — 7-8-суточные. Зараженные яйца помещают в термостат при влажности 45-60% и инкубируют при оптимальной для каждой группы риккетсий температуре до массовой гибели эмбрионов. Оптимальной температурой для накопления риккетсий группы сыпного тифа, ориенций и R. akari является 35°С, риккетсий группы клещевых пятнистых лихорадок — 33°С.

При культивировании учитывают сроки гибели зараженных эмбрионов, видимые изменения (геморрагические поражения), интенсивность накопления риккетсий. Погибшие в течение 3 сут. после заражения эмбрионы отбраковывают (неспецифические проявления, чаще — гибель, связанная с травматизацией). При дальнейшей ежедневной овоскопии отбирают для вскрытия погибшие эмбрионы (отсутствие подвижности, утрата сосудистого узора).

Гибель эмбрионов при культивировании риккетсий группы сыпного тифа наступает в более поздние сроки (6-10-е сутки после заражения, иногда и позже), чем риккетсий группы КПД (4-6-е сутки), сопровождается более интенсивным накоплением риккетсий при менее выраженных изменениях геморрагического характера. Заражение куриных эмбрионов коксиеллами Бернета вызывает относительно позднюю гибель эмбрионов (6-8-е сутки) при интенсивном размножении возбудителя без выраженных изменений самого эмбриона.

Для культивирования риккетсий могут быть использованы как первично трипсинизированные, так и перевиваемые культуры клеток. Большинство видов риккетсий размножаются в культурах клеток почечного эпителия, мезотелия, перевиваемых линиях клеток Vero, HeLa, Hep-2, L929. Коксиеллы Бернета хорошо размножаются также в культурах фибробластов куриного эмбриона и морских свинок, макрофагов и ретикулярных клеток костного мозга и селезенки. Получены данные о возможности культивирования на культурах клеток Vero и Нер-2 риккетсий, не культивируемых на традиционных моделях — морских свинках и куриных эмбрионах (R. tarasevichiae, риккетсии подгруппы R. massiliae).

Для пассирования культуры клеток подвергают версенизации по стандартной методике. Культуры клеток Vero и Нер-2 выращивают в стеклянных флаконах, засев проводят в концентрации 150 тыс. клеток на 1мл. В качестве питательной среды используют среду Игла М ЕМ с двойным набором аминокислот, к общему объему добавляют до 10% эмбриональной сыворотки. Подготовленные флаконы заражают 10%-ной риккетсиальной суспензией в объеме 0,5 мл на флакон. Флаконы с зараженным содержимым центрифугируют при 800 об/мин при температуре 22°С в течение 30 мин. После центрифугирования во все флаконы добавляют среду поддержки (Игла МЕМ с добавлением эмбриональной сыворотки до 1%) в объеме 1,5 мл на флакон. Флаконы с зараженными клетками культивируют в углекислотном термостате при температуре 35,6°С в течение 8 сут.

После завершения инкубации все флаконы подвергают замораживанию в низкотемпературном холодильнике на -20°С, а потом оттаиванию для разрушения клеток и максимального выхода из них микроорганизмов. После оттаивания материал центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин, супернатант в объеме 0,5 мл берут на следующий пассаж, а из 0,2 мл делают мазки. Остатки супернатанта хранят в криопробирках в низкотемпературном холодильнике. Инфицированность и стерильность культуры клеток определяют в мазках, окрашивая их по Романовскому-Гимзе и методом флюоресцирующих антител. Отсутствие посторонней микрофлоры в пассажах контролируют также посевом на питательные среды (сахарный бульон, тиогликолевая среда, среда Сабуро, среды на микоплазмы).

Развитие инфекции в клеточных культурах у различных видов родов Rickettsia и Orientia отличается. Для риккетсий Провачека и ориенций цуцугамуши характерно накопление микроорганизмов в больших количествах в отдельных клетках. Дегенеративные изменения клеток вследствие перепроизводства возбудителя сопровождаются их разрывом и освобождением микроорганизмов с распространением инфекции на соседние клетки.

У риккетсий группы КПЛ накопление возбудителя в отдельных клетках не сопровождается их переполнением, риккетсии еще на ранней стадии выходят из клеток без существенных их повреждений с быстрым распространением инфекции клеточной культуры. Дегенеративные изменения клеток обусловлены преимущественно токсическим действием риккетсий.

Методы выделения и последующей идентификации риккетсий требуют специальной подготовки, соблюдения режимных требований (возбудители 2-3-й группы патогенности). К возбудителям 2-й группы патогенности относят R. prowazekii, Coxiella burnetii, R. rickettsii. Их культивирование можно осуществлять в специализированных риккетсиологических лабораториях или лабораториях особо опасных инфекций, что ограничивает возможности использования методов выделения риккетсий в диагностических целях.

При изучении штаммов риккетсий придерживаются общей схемы дифференциации, предложенной П.Ф. Здродовским и Е.М. Голиневич (1972), которая включает:
а) изучение морфологии;
б) характеристику размножения при культивировании в желточных мешках куриных эмбрионов;
в) воспроизведение экспериментальной инфекции на лабораторных животных;
г) иммунологическую характеристику в опытах перекрестного иммунитета;
д) серологический анализ антигенной структуры.

Для группоспецифической идентификации риккетсий группы КПЛ можно использовать РСК с сыворотками крови биопробных морских свинок и цельнорастворимыми антигенами оригинальных штаммов риккетсий и музейных штаммов известных видов. Дифференциация риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ) ранее базировалась преимущественно на учете их токсических свойств, а также использовании корпускулярных антигенов и иммунных мышиных сывороток для идентификации риккетсий. Можно использовать метод флюоресцирующих антител с мазками-отпечатками желточных мешков куриных эмбрионов, ИФА и РНГА с иммуноглобулиновым диагностикумом для выявления риккетсий группы КПЛ и сыпного тифа производства Пермского филиала НПО «Микроген».

Дальнейшая идентификация проводится в перекрестной РСК с сыворотками мышей СВА и набором антигенов риккетсий, в реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) — с моноклональными антителами к риккетсиям, а также при помощи генетических методов (рестрикционный анализ ДНК, ДНК-зондирование, ПЦР с использованием праймеров области гена цитратсинтазы и белкового антигена 190 кД и др.).

а) Серологическая диагностика. У риккетсий и ориенций выявлено наличие перекрестно реагирующих эпитопов с протеями. Реакция агглютинации Вейля-Феликса с протеями была первым тестом, использованным для серодиагностики риккетсиозов. Антигены из клеточных стенок Proteus vulgaris ОХ-2 реагируют в реакции агглютинации с сыворотками больных риккетсиозами группы КПЛ, за исключением пятнистой лихорадки Скалистых гор, Proteus vulgaris OX-19 - с сыворотками крови больных риккетсиозами группы СТ и пятнистой лихорадки Скалистых гор. Сыворотки больных болезнью Брилля-Цинссера и осповидного (вызываемого R. akari) риккетсиоза обычно не вступали в реакцию агглютинации Вейля-Феликса. Ориенции не имеют антигенных связей с риккетсиями групп СТ и КПЛ, однако имеют общие антигенные детерминанты с Proteus mirabilis ОХК, выявляемые в реакции Вейля-Феликса.

Реакцию Вейля-Феликса с протейными антигенами и варианты реакции агглютинации со специфическими риккетсиозными антигенами в настоящее время применяют редко в связи с недостаточной чувствительностью и специфичностью. Существует более чувствительный метод микроагглютинации с меченными флюорохромом риккетсиями для серодиагностики риккетсиозов группы СТ производства Пермского филиала НПО «Микроген», однако не нашедший широкого применения в практике.

В течение многих десятилетий реакция связывания комплемента (РСК) являлась базовым методом серологической диагностики риккетсиозов. Метод обладает высокой групповой специфичностью даже при низких (1:10 — 1:20) разведениях сывороток, однако недостаточно чувствителен в ранней фазе заболевания. Комплементсвязываюшие антитела при большинстве риккетсиозов групп СТ и КИЛ выявляют в конце первой — начале второй недели инфекции, в некоторых случаях — в более поздние сроки. Наличие группоспецифического полисахаридного комплекса в составе препарата растворимого антигена для РСК приводит к отсутствию четкой видовой дифференциации внутри групп СТ и КПЛ, хотя титры антител обычно бывают выше к гомологичному антигену.

Группоспецифическая диагностика риккетсиозов группы КПЛ в РСК в России осуществляется с растворимым антигеном R. sibirica, в Америке — с R. rickettsii, в Европе — с R. conorii, что определяется распространением важнейших риккетсиозов этой группы — клещевого сыпного тифа Северной Азии, пятнистой лихорадки Скалистых гор и марсельской лихорадки соответственно. Более четкая видовая дифференциация внутри групп осуществляется при помощи корпускулярных антигенов, но чаще не в РСК, а в РНИФ. Антигены и другие ингредиенты для РСК выпускаются Пермским филиалом НПО «Микроген».

Реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА) применяют для диагностики риккетсиозов как группы СТ, так и группы КПЛ. В качестве гемосенситина используют комплекс липополисахарида (ЛПС) и белковых антигенов. В нашей стране метод применяется преимущественно для выявления антител к риккетсиям группы СТ. Препарат выпускается Пермским филиалом НПО «Микроген». РНГА — наиболее ранний чувствительный метод выявления текущей (острой) риккетсиозной инфекции, выявляет преимущественно lgM-антитела, быстро исчезающие после перенесения инфекции. Латекс-агглютинация в целом близка по своим параметрам к РИГА, используется как метод первичного тестирования сывороток крови, группоспецифична, выявляет как IgM-, так и IgG-антитела, но в связи с высокой перекрестной реактивностью внутри группы СТ не позволяет дифференцировать эпидемический и эндемический сыпной тиф.

Иммуноферментный анализ (ИФА) применяют для серодиагностики риккетсиозов групп СТ и КПЛ, лихорадки цуцугамуши. Используют различные варианты ИФА с ренографин-очищенными антигенами для сенсибилизации планшет. По чувствительности и специфичности ИФА сопоставима с РНИФ, однако имеет некоторые преимущества при выявлении низких титров антител (у вакцинированных, в период поздней реконвалесценции), что можно использовать при ретроспективном эпидемиологическом анализе. В России выпускают тест-системы ИФА для выявления антигенов коксиелл Бернета и антител к ним (Санкт-Петербургский НИИЭМ им.Пастера).

Реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) считается золотым стандартом серологической диагностики риккетсиозов, используемым в большинстве лабораторий. Метод обладает высокой специфичностью и чувствительностью, воспроизводимостью, позволяет выявлять IgM- и IgG-антитела как вместе, так и раздельно в зависимости от применяемых конъюгатов. При риккетсиозах группы КПЛ и лихорадке цуцугамуши диагностически значимые титры IgM-антител выявляют в конце первой недели, IgG-антител — в конце второй недели заболевания. В России корпускулярных антигенов для РНИФ не выпускают, экспериментальные серии производят НИИЭМ им.Гамалеи РАМН, Омский НИИ природноочаговых инфекций, Санкт-Петербургский НИИЭМ им.Пастера.

Методом подтверждения стандартных серологических методов диагностики является иммуноблоттинг. Показано, что перекрестно реагирующие антитела направлены против ЛПС и относятся к IgM-антителам, IgG-антитела образуются как к ЛПС, так и к белковым антигенам риккетсий. Коммерческие наборы для им-муноблоттинга находятся в стадии разработки.

Диагноз коксиеллеза вследствие полиморфизма клинического течения невозможен без лабораторного подтверждения. Основной метод — РСК. Наряду с ним используют более чувствительные методы — РНИФ и ИФА. У больных преобладают антитела к антигену С. burnetii фазы 2; антитела к антигену фазы 1 преобладают при формировании хронического течения.

б) Генетические методы. Генетические методы находят все более широкое применение для изучения и идентификации риккетсий. Среди них используют анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ДНК (ПДРФ), метод геномной дактилоскопии (ДНК-зонды), анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов амплифицированной в полимеразной цепной реакции ДНК (ПДРФ аДНК ПЦР), пульсовый гелевый электрофорез, метод сравнения нуклеотидных последовательностей.

Рестрикционный анализ требует для своего осуществления большого количества ДНК, что на первых этапах генетического изучения риккетсий требовало накопления биомасс риккетсий на чувствительных моделях (желточные мешки куриных эмбрионов, культуры клеток). Использование методов, основанных на полимеразной ценной реакции, является более рациональным. При этом не только не требуется длительное культивирование микроорганизмов, но часто эти варианты генетического анализа оказываются более чувствительными и специфичными.

Несмотря на высокую перспективность, особенно для диагностики новых риккетсиозов и анаплазмозов, эти методы не нашли широкого применения в практике ввиду сложности и трудоемкости, а также в связи с методическими проблемами взятия и исследования клинического материала от больных. Тем не менее при помощи методов генодиагностики в последние годы доказана этиологическая значимость возбудителей ряда новых риккетсиозов — вызываемого R. slovaca синдрома TIBOLA (англ. — tick borne lymphoadenopathy — лимфоаденопатия после присасывания клеща), вызываемого R. heilongjiangii клещевого риккетсиоза и др.

в) Определение чувствительности к антибактериальным препаратам. С учетом внутриклеточного цикла жизни риккетсий определение их антибиотикочувствительности классическими микробиологическими методами невозможно. Для этих целей используют лабораторных животных, развивающиеся куриные эмбрионы и различные модели клеточных культур.

- Читать далее "Семейство Anaplasmataceae: таксономия"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 17.2.2020