Лабораторная диагностика сальмонелл (Salmonella)

Лабораторная диагностика строится в соответствии с патогенезом заболевания. Выбор материала для исследования при подозрении на брюшной тиф зависит от срока, прошедшего с момента заболевания. В первые дни, когда наблюдается бактериемия, исследуют кровь, которую засевают в желчный бульон или среду Раппопорт в соотношении 1:10. Посевы помещают в термостат при 37°С. На 3-5-7-е сутки делают высев на дифференциально-диагностические среды Плоскирева, Эндо, висмут-сульфит агар. При обнаружении прозрачных или полупрозрачных бесцветных либо светло-розоватых, не разлагающих лактозу (на средах Плоскирева или Эндо), и серовато-зеленых с черным центром (на висмут-сульфит агаре) колоний их идентифицируют по ферментативным свойствам, затем определяют антигенную структуру в реакции агглютинации на стекле с О- и Н-агглютинирующими сыворотками.

Идентификацию колоний, выросших на средах для первичного посева, проводят при помощи набора тестов, позволяющих определить таксономически значимые признаки, а следовательно, и родовую принадлежность выделенных культур. Отобранные колонии засевают на короткий ряд: агар Клиглера, среду с мочевиной, нитратный агар Симмонса, в пробирку с полужидким 0,3-0,4% агаром, под пробку которой помещают индикаторную бумажку для выявления образования индола.

На второй неделе заболевания исследуют фекалии и/или мочу. Идентификацию выделенных культур проводят аналогично. S. typhi фаготипируют при помощи набора Vi-фагов. Определение фаготипа необходимо для эпидемиологического анализа вспышек брюшного тифа.

В это же время проводят серодиагностику, ставят реакцию Видаля с О- и Н-диагностикумом. Основное диагностическое значение имеет реакция с О-диагностикумом, диагностический титр 1:200.

При подозрении на бактерионосительство материалом для исследования служат кал и моча.

Схема выделения и идентификации S. typhi и S. paratyphi А и В сводится к следующему.

Лабораторная диагностика сальмонелл (Salmonella)

Первый день. Посев исследуемого материала на соответствующие дифференциально-диагностические среды (кровь — в желчный бульон, среду Раппопорт; фекалии — на среду Плоскирева, висмут-сульфит агар) и среды обогащения. Посевы помещают в термостат при 37°С. При подозрении на пищевую токсикоинфекцию исследуют рвотные массы и промывные воды желудка.

Второй день:

1. Просматривают чашки, засеянные накануне, отбирают подозрительные колонии (не менее трех).

2. Отобранные колонии засевают на агар Клиглера (посев сначала делают на скошенную поверхность, а затем уколом в столбик), среду с мочевиной, полужидкий (0,3-0,4%) агар (под пробку этой пробирки помещают индикаторную бумажку на индол).

3. Производят высев со сред обогащения на среду Плоскирева и висмут-сульфит агар.

Третий день:

1. Гемокультуры высевают на среду Плоскирева и висмут-сульфит агар с желчного бульона или среды Раппопорт.

2. Учитывают ферментативные свойства посеянных накануне культур. Культуры, не ферментирующие лактозу (скошенная поверхность агара Клиглера розово-малинового цвета), подвижные, образующие сероводород, не гидролизующие мочевину, не образующие индола, ферментирующие глюкозу с образованием кислоты, подозрительны на S. typhi.

3. Производят посев этих подозрительных культур на среду с лизином, цитратный агар Симмонса, среду Кларка, среды с углеводами для определения биовариантов. Дополнительные характеристики необходимы для подтверждения родовой принадлежности выделенных штаммов.

4. Высевают колонии, выявленные со сред обогащения, на короткий ряд тестов (см. второй день).

5. Делают посев культур на скошенный агар для определения антигенной структуры сальмонелл.

Четвертый день:

1. Просматривают чашки с посевом гемо культуры, отбирают подозрительные колонии и делают посев на короткий ряд.

2. Учитывают ферментативные свойства по дополнительным тестам.

3. Производят посев на дополнительные тесты культур со сред обогащения.

4. При обнаружении сальмонелл проводят определение О-, Н-, Vi-антигенов при помощи диагностических агглютинирующих сывороток в реакции агглютинации на стекле. Реакцию сначала ставят с поливалентными О-сыворотками, затем определяют О-группу. После определения О-антигена определяют Н-антигены: устанавливают наличие I и II фаз с соответствующими монорецепторными сыворотками. Для реакции агглютинации с О-сыворотками культуру берут с верхней части скошенного агара, для Н-агглютинации — с нижней. При обнаружении S. typhi культуру агглютинируют с монорецепторными Vi-и О-сыворотками. На основании полученных данных выдают ответ.

а) Молекулярно-генетические методы типирования изолированных штаммов сальмонелл. В последние годы для лабораторной диагностики сальмонеллезной инфекции применяют различные молекулярно-генетические методы, позволяющие выявлять специфические фрагменты ДНК возбудителя в клиническом материале (экспресс-диагностика), а также типировать изолированные штаммы с целью выявления очага инфекции.

Ниже приведена краткая характеристика различных молекулярно-генетических методов, используемых для типирования и субтипирования изолятов.

Оценка полиморфизма длины рестрикционных фрагметов (ПДРФ) плазмидной и хромосомной ДНК успешно применяется для субтипирования изолятов сальмонелл. Поскольку рестрикция бактериальной геномной /(НК эндонуклеазами, распознающими короткие последовательности из 4 или 6 нуклеотидов, приводит к образованию нескольких сотен фрагментов, то после электрофореза получается обычно достаточно сложный для интерпретации и сравнения профиль ДНК-фрагментов. Саузерн-блоттинг разделенных фрагментов и их гибридизация с мечеными ДНК-фрагменгами уменьшает сложность образцов, но увеличивает число требуемых манипуляций и время, требуемое для проведения исследования.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Методы, основанные на ПЦР с использованием произвольных (arbitrary, англ.) праймеров (RAPD-типирование), намного проще и требуют меньше времени, поэтому широко используются для изучения вспышек сальмонеллезов, ограниченных во времени. Метод удобен для использования в ежедневной практике как дополнение к серо- и фаготипированию, если последние не являются достаточно информативными. Высокой разрешающей способностью обладает метод Rep-PCR, основанный на амплификации повторяющихся нуклеотидных последовательностей. Одним из наиболее широко используемых методов для выявления точечных мутаций в связи с его простотой, чувствительностью и скоростью является метод ПЦР-SSCP (single-strand conformation polymorphism, англ.), который также применяют для типирования сальмонелл. Время, необходимое для проведения ПЦР-SSCP, составляет менее 24 ч.

Метод пульс-гель-электрофореза (pulsed field-gel electrophoresis, PFGE). Техника пульс-электрофореза позволяет эффективно разделять фрагменты бактериальной ДНК, обработанной крупнощепящими рестриктазами, что облегчает раздельное перемещение крупных фрагментов ДНК в агарозном геле путем постоянного изменения направления электрического поля в ходе электрофореза. Небольшое число фрагментов ДНК (обычно 10-20) облегчает интерпретацию результатов. Неоднократно показано, что PFGE превосходит другие методы субтипирования сальмонелл по точности и дифференцирующей силе. PFGE в основном формате (лизис бактериальных клеток для выделения неповрежденной хромосомной ДНК, удаление примесей, нарезание хромосомной ДНК соответствующими рестриктазами, пульс-электрофорез фрагментов ДНК и их визуализация) может быть применен как универсальный метод субтипирования многих бактерий. Полученные в пульс-гель-электрофорезе профили рестрицированной ДНК стабильны и хорошо воспроизводимы на внутри-и межлабораторном уровне. В настоящее время PFGE является методом выбора для эпидемиологического типирования сальмонелл в эпидемиологических целях.

Широкое применение молекулярно-генетических методов типирования сальмонелл породило новые проблемы. Поскольку эти методы могут быть выполнены в любой специально оборудованной лаборатории, они стали широко применяться без должной стандартизации и адекватных критериев интерпретации. Различные лаборатории использовали разные методы типирования. Даже если использовался один и тот же метод, существовали различия в протоколах, которые лишали лаборатории возможности сопоставлять результаты типирования. Каждая лаборатория использовала собственную систему обозначений для получаемых профилей, и эти обозначения не имели значения в других лабораториях, где существовали иные системы.

С целью разработки стандартизованных протоколов молекулярного типирования для всех бактериальных диарейных инфекций в США Центром контроля заболеваний (CDC) был основан проект PulseNet, первоначально объединивший 10 лабораторий. PulseNet — система раннего предупреждения вспышек инфекций с пищевым путем передачи возбудителя. В настоящее время PulseNet — национальная сеть молекулярного типирования возбудителей инфекций, передающихся с пищей, которая является сетью лабораторий системы здравоохранения и CDC. Эти лаборатории проводят типирование ДНК бактерий (Escherichia coli 0157:117, Salmonella, Shigella, Listeria и Campylobacter) с использованием стандартизированных оборудования и методов. Сеть позволяет проводить быстрое сравнение профилей PFGE-типирования через электронную базу данных, предоставляет данные для раннего выявления и своевременного расследования вспышек с целью снижения числа случаев заболеваний. Лаборатории-участницы имеют электронный доступ к серверу, могут предоставлять информацию о новых PFGE-профилях и получать информацию о профилях, существующих в базе данных. Аналогичные модели на различных стадиях развития имеются в азиатско-тихоокеанском регионе и в Южной Америке.

Метод пульс-гель-электрофореза (PFGE) профиля рестрицированной ДНК широко применяется в Европейском Союзе при расследовании международных вспышек, обусловленных S.enterica, включая серотипы Enteritidis, Typhimurium, Anatum, Virchow и Hadar. Разработан стандартный лабораторный протокол для PFGE и для компьютерного анализа результатов; создана электронная база данных PFGE, представляющая доминирующие в настоящее время в Европе серотипы; проводится PFGE-типирование в режиме реального времени большого количества изолятов сальмонелл в каждой из стран-участниц с использованием критериев выбора, которые повышают возможности обнаружения вспышки, и непрерывный анализ данных в диалоговой базе данных; создана внешняя система контроля качества PFGE-исследований. В настоящее время создается диалоговая поисковая сетевая база данных, содержащая информацию о наиболее распространенных в Европе серотипах и фаготипах сальмонелл. Участники представляют все ДНК-профили и связанную с ними эпидемиологическую информацию по электронным сетям в центр координирования, в котором эти сведения вносятся в центральную базу данных. Эта международная база данных обслуживается в центре координирования и доступна для всех участников через Интернет. Следует отметить, что эпидемиологическая база данных будет систематически анализироваться и результаты сообщаться всем участникам.

б) Фаготипирование:

1. Фаготипирование брюшнотифозных бактерий. Для эпидемиологического анализа полезно фаготипирование брюшнотифозных бактерий. Широкое международное признание получила схема дифференциации на фаговары S. typhi, основанная на строго специфическом отношении этих бактерий к адаптированным Vi-фагам II серологического типа. По этой схеме S. typhi можно дифференцировать на 96 фаговаров. Важным условием фаготипирования штаммов S. typhi является наличие у бактерий Vi-антигена.

Для установления фаговара суточную культуру, выращенную на агаре, пересевают в пробирки с 2-3 мл мясопептонного бульона и помещают в термостат при 37°С на 3-4 ч. Молодую бульонную культуру засевают газоном на подсушенный слабощелочной агар в чашках Петри. На чашки бактериальную культуру наносят петлей диаметром 5 мм или тонко оттянутой пастеровской пипеткой. Число капель культуры должно быть в 3 раза больше числа используемых бактериофагов, поскольку одну из них испытывают с Vi-фагом, вторую — с О-сальмонеллезным поливалентным фагом, третья — контроль культуры. После подсыхания фага чашки помещают в термостат. Результаты учитывают через 5-6 ч и 18-20 ч. Фаговар определяют по схеме, прилагаемой к набору фагов.

2. Фаготипирование штаммов S. paratyphi А и S. paratyphi В. Фаготипирование штаммов S. paratyphi А осуществляют по международной схеме, включающей 6 специфических бактериофагов и позволяющей определить 6 фаговаров этих бактерий.

Фаготипирование штаммов S. paratyphi В проводят по схеме Felix и Kellow, которая включает 11 бактериофагов, позволяющих определить 13 основных фаговаров. Установление фаговара основано на определении спектра лизиса исследуемого штамма несколькими типовыми бактериофагами.

в) Серодиагностика брюшного тифа и паратифов. Серодиагностика возможна начиная со 2-й недели заболевания. В крови больных к этому времени накапливается достаточное количество агглютининов к О- и Н-антигенам соответствующего возбудителя, которые можно обнаружить в реакции Видаля с тифозными и паратифозными диагностикумами. Реакцию ставят как обычную линейную реакцию агглютинации. Из исследуемой сыворотки крови больного готовят 4 ряда последовательных двукратных разведений с 1:100 до 1:1600-1:3200. В каждую пробирку добавляют по 1-2 капли диагностикумов: в 1-й ряд — брюшнотифозный О, во 2-й ряд — брюшнотифозный ОН, в 3-й ряд — паратифозный А, в 4-й ряд — паратифозный В. Последняя пробирка каждого ряда служит контролем антигена (сыворотки не содержит); контролем сыворотки служит одна пробирка с минимальным разведением. Все пробирки помещают в термостат при 37°С на 2 ч. Результат учитывают общепринятым методом, в соответствии с «Инструкцией» по применению диагностикумов.

- Читать далее "Морфологические, тинкториальные свойства шигелл (Shigellae)"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 30.12.2019

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.