а) Строение клеточной стенки В. cepacia:

1. Клеточные липиды. Как и у других грамотрицательных бактерий, клеточная стенка штаммов В. cepacia обладает комплексом слоев, в которых тонкий слой пептидогликана расположен между цитоплазматической и наружной мембранами. Наружная мембрана включает в себя липиды, белки (БНМ) и липополисахарид (ЛПС). Полярные липиды представлены двумя формами: фосфатидилэтаноламин (ФЭ) и орнитин-аминолипид (ОЛ), различающиеся только наличием или отсутствием 2-гидрооксижирных кислот.

Орнигиносодержащие липиды составляют 10-15% от общего количества клеточных липидов с преобладанием ОЛ2 над ОЛ1. В. cepacia содержат 2-гидрооксикислоты, представленные ФЭ2 и ОЛ2, что отличает ее от других видов рода Burkholdeiia. На липидный состав (особенно увеличение 2-гидрооксикислот в ФЭ1) значительно влияет температура выращивания, скорость роста, а также соотношение между ФЭ и ОЛ.

2. Белки наружной мембраны (БНМ). Для клинических изолятов В. cepacia характерны два типа профилей БНМ. Первый тип характеризуется протеинами с молекулярной массой 39, 27 и 18 kDa, во второй тип БНМ входят протеины с молекулярной массой 80-90 kDa, образующиеся в условиях, ограничивающих рост. Белки с молекулярной массой 39 и 27 kDa выполняют функцию поринов для небольших гидрофильных структур, являются антигенами и отвечают за резистентность к антибиотикам (см. ниже). Главный порин белок OpcPl, кодируемый геном орсР, имеет молекулярную массу 35,7 kDa. Среди описанных БНМ имеется белок с молекулярной массой 80 kDa, используемый для выявления колонизации В. cepacia в ИФА у муковисцидозных больных.

У штаммов геномовара III (В. cenocepacia) имеется возможный гем-образующий белок с молекулярной массой 97 kDa. Этот протеин локализован в наружной мембране, связывает железо III протопорфирина-18 и служит в качестве рецептора железа, чем способствует отложению ферригемов, которые защищают бактериальную клетку от перекиси водорода, вырабатываемой нейтрофилами в воспаленном легком.

Два других гемин-связанных БНМ с молекулярной массой 77 и 147 kDa выявлены у штаммов В. cepacia геномовара IIIа, в условиях повышенных концентраций железа III протопорфирина-9. Эти белки не обнаружены в штаммах В. cepacia геномовара I. Возможно, они причастны к вирулентности микроорганизмов и могут считаться кандидатами в разрабатываемые вакцины.

Экзополисахариды. Штаммы В. cepacia образуют два различных кислых экзополисахарида ПСI и ПСII. ПСI характеризуется повторением дисахаридных единиц, тогда как ПСII имеет более сложные гептасахаридные повторяющиеся единицы.

ПСI образует большинство изученных мукоидных штаммов, хотя он был обнаружен одновременно с ПСП в двух штаммах В. cepacia, выделенных из окружающей среды. Штаммы В. cepacia редко вырастают в мукоидной форме на агаровой среде, но образуют экзополисахариды при выращивании на глицериновой среде с высоким содержанием поваренной соли.

б) Факторы патогенности В. cepacia. Штаммы В. cepacia, выделенные от животных и растений, являются относительно авирулентными (LD₅₀ — 10⁸ КОЕ на нормальную мышь), но обильно персистируют на ожоговой модели мышей.

Представители данного вида образуют различные предполагаемые факторы, которые способствуют их патогенности для животных, растений и людей.

1. Липополисахариды (эндотоксин) и антигенные разновидности. Лииополисахарид (ЛПС) штаммов В. cepacia имеет большое значение среди факторов патогенности, поскольку принимает участие в усилении воспалительного ответа у больных муковисцидозом, инфицированных этими бактериями. Эндотоксин ЛПС имеет относительно низкую токсичность: значение LD₅₀ у мышей равно приблизительно 1,0 мг, но по сравнению с эндотоксином, полученным из штаммов Р. aeruginosa, он обладает более высокой токсической активностью.

ЛПС штаммов В. cepacia представляют собой иммунодоминантные структуры на поверхности наружной мембраны. Они составляют основу ее архитектуры, сходной с таковой у энтеробактерий, и включают в себя липид А, ядра олигосахарида и боковые типовые О-специфические цепи (О-антиген).

Однако они имеют некоторые особенности:
1) низкую степень фосфорилирования в ядре олигополисахарида;
2) обширную замену 4-амино-4-дезокси-L-арабинозы в липиде А;
3) низкое содержание III-дезокси-В-манно-2-октулосониковой кислоты (KDO);
4) замену KDO на D-глицеро-α-D-тало-2-октулосониковую кислоту (КО). Этот дисахарид также присутстувует в В. pseudomallei; и
5) наличие двух разных полимерных фракций в нескольких референтных штаммах В. cepacia, что приводит к трудностям идентификации индивидуальных О-антигенов и в некоторых случаях снижает сероспецифичность.

По сравнению со многими бактериями штаммы В. cepacia образуют более простые полимеры в структуре их О-антигенов. Полимеры В. cepacia являются линейными ди- или трисахаридами, повторяя эти элементы, а некоторые из них содержат элементы моносахаридов. Многие из таких полимеров встречаются также и у других видов грамотрицательных бактерий. Идентичные структуры имеются и в штаммах В. vietnamiensis.

Химическая структура О-антигена штаммов В. cepacia, выделенных из окружающей среды, оказалась уникальной для антигенов рода Burkholderia.

Описаны три схемы серологического типирования изолятов В. cepacia по О-антигенам, но наиболее широко используется схема В. Werneburg и Н. Monteil (1989). С ее помощью можно дифференцировать виды на 9 О- и 5 Н-серотипов со степенью типируемости 98% и 43%, соответственно. Она применима для штаммов, выделенных как из окружающей среды, так и в случае внутрибольничных инфекций. Степень типируемости заметно снижается для штаммов, выделенных от больных муковисцидозом. Не было выявлено корреляции О-серотипа с принадлежностью к геномовару штаммов. Е. Evans с соавт. (1999) использовали метод SDS (додецилсульфат Na)-электрофореза в полиакриламидном геле и иммуноблотинг для выявления хемотипа и антигенных перекрестных реакций 16 штаммов В. cepacia четырех геномоваров.

Все штаммы геномоваров I и II имели гладкий хемотип ЛПС, а штаммы геномовара III вирулентной линии ЕТ-12 имели или шероховатый, или гладкий хемотип ЛПС.

2. Сидерофоры — желто-зеленые флуоресцирующие водорастворимые пигменты, которые выполняют функцию связывания и транспорта железа в клетке бактерий, и которые продуцируются всеми видами комплекса В. cepacia.

Известны по меньшей мере 4 различных компонента сидерофоров, образуемых штаммами В. cepacia, включая орнибактины, пиохелин, салициловую кислоту (прежде — азурохелин) и цепабактин. Орнибактины и сиалициловую кислоту образуют большинство клинических штаммов. Для синтеза орнибактина необходимы два гена (pvdА и pvdD) с существенной гомологией с генами пиовердина Р. aeruginosa. Наружный мембранный белок с предполагаемой молекулярной массой 81,7 kDa необходим для утилизации орнибактина при транспорте железа или для роста. Мутант, лишенный этого белка, существенно менее вирулентен, чем родительский штамм.

В. cepacia содержит белок-регулятор захвата железа (fur), fur-ген которого имеет 90% гомологии с последовательностями fur-гена В. pseudomallei.

3. Липазы различных типов включают: эстеразы и лецитиназы, белок с молекулярной массой 25 kDa, который действует на твины, имеет не связанные между собой фосфолипазную-С и гемолитическую активности, в отличие от Р. aeruginosa. Штаммы В. cepacia, изолированные от больных муковисцидозом, обладали цитотоксичностью; примерно 40% выделенных штаммов проявляли гемолитическую активность. Описан гемолизин, индуцирующий апоптоз (запрограммированную смерть клетки) и активизирующий дегрануляцию фагоцитов млекопитающих. Это соединение было идентифицировано как липопептид, снижающий поверхностное натяжение. Доказана его функциональная роль в супрессии иммунного ответа организма хозяина.

4. Жгутики и пили. Подобно штаммам Р. aeruginosa, бактерии В. cepacia экспрессируют два типа жгутиковых белковых антигенов — флагеллины, которые различаются по молекулярной массе. Флагеллины типа 2 имеют молекулярную массу около 45 kDa и легко дифференцируются в электрофорезе в полиакриламидном геле (PAGE) от флагеллина типа 1 с молекулярной массой 55 kDa. Диаметр жгутика с флагеллином типа 1 был заметно больше, чем у жгутика типа 2 (приблизительно 45,5 нм против 18 нм). N-концевая последовательность флагеллина 2-го типа свидетельствует о близком сходстве его с флагеллином В. pseudomallei. Жгутики способствуют вирулентности многих бактериальных видов, и В. cepacia не является исключением.

М. Tomich et al. (2002) выявили способность клинических штаммов В. cenocepacia (геномовар III) к инвазии в культивируемые клетки дыхательного эпителия, связанной с наличием жгутиков. Утрата подвижности у мутантов вследствие разрушения локуса JUG строго коррелировала со снижением инвазивности, но не была связана с нарушением адгезии мутанта к тестируемым клеткам.

В штаммах В. cepacia были идентифицированы по крайней мере 5 различных видов структур пилей, в том числе канатные (англ. cable), или контагиозные пили, которые оказались связаны с распространением эпидемического клона (линии) ЕТ-12 в США и Великобритании, в то же время как закрученные (англ. mesh) пили ассоциированы с распространением как эпидемических, так и неэпидемических штаммов, выделенных от больных муковисцидозом. Остроконечные (англ. spike) пили обычно связаны со штаммами, выделенными из окружающей среды.

Белок с молекулярной массой 22 kDa локализован на канатных пилях, обеспечивая высоко аффинное связывание клеток с дыхательными муцинами и эпителиальными клетками легкого через рецептор цитокерагин 13, экспрессия которого повышена в легких больных муковисцидозом.

Штаммы, экспрессирующие канатные пили, образуют большие скопления на поверхности клеток-мишеней, тогда как штаммы В. cepacia, экспрессирующие другие пили, атакуют ткани преимущественно в виде единичных клеток. Декстраны (10 000 Da) вызывали обратимую ингибицию адгезии буркхолдерий к клеткам, более эффективную в отношении штаммов В. cepacia, экспрессирующих не канатные пили.

5. Желатиназа и другие протеиназы. Описана внеклеточная желатиназа — Zn-металлопротеаза с молекулярной массой 36 kDa, которая была выделена и очищена из штамма В. cepacia, вызывающего бронхопневмонию при введении ее в трахею крыс. Эта протеаза расщепляет желатин, порошок из кожи и коллаген человека I, IV, V типов. Иммунизация животных этим белком (конвертируемой металлопротеиназой) приводила к существенному облегчению течения тяжелой экспериментальной легочной инфекции. Генетический анализ показал, что последовательности аминокислот этой протеазы, выделенной из штаммов В. cepacia и В. pseudomallei, были схожи с последовательностями гемолизиноподобного семейства металлопротеиназ.

6. Муцин-сульфатазы штамма В. cepacia также могут активно разрушать дыхательный муцин. Десульфанирование приводит к повышению чувствительности муцинов к деградации бактериальными энзимами, что способствует освобождению углеводов и аминокислот. Муцин-сульфатазная активность была определена во всех 9 изученных штаммах В. cepacia и в 4 из 6 штаммах Р. aeruginosa. Была выявлена арил-сульфатазная активность штаммов В. cepacia, но ее уровни были в 20 раз ниже, чем в штаммах Р. aeruginosa.

7. Система «Quorum sensing» (чувство кворума) и ее роль в патогенности В. cepacia. Совместная колонизация больных муковисцидозом штаммами Р. aeruginosa и бактериями комплекса В. cepacia наблюдается не часто, однако наличие одновременно этих двух видов связывают с повышением смертности больных. Совместная причастность представителей этих видов осуществляется через N-ацил-гемосеринлактон (АГЛ) — «Quorum sensing» механизм с возможным эффектом координированной регуляции экспрессии их факторов патогенности. В штаммах В. cepacia-комплекса система Quorum sensing CepIR регулирует экспрессию протеазы, биосинтез орнибактина, роящуюся подвижность и образование биопленки. Показано, что эта система дифференцирует регуляцию плотности клеточной популяции.

Вторая система (Bvi IR) действует в штаммах В. vietnamiensis.

Клеточные сигнализирующие гены — в частности, ген синтеза АГЛ-синтазы и соответствующего ему транскипционного регулятора, в штаммах В. cenocepacia локализованы на «острове патогенности» размером 31,7 kb.

8. Образование биопленок В. cepacia. Около 80% известных видов бактерий способны образовывать биопленки. Не являются исключением и бактерии рода Burkholdeiia. Причинами инфекционных осложнений часто бывают различные медицинские манипуляции, связанные с использованием катетеров, искусственных клапанов сердца, протезов и даже медицинских приборов. Теперь известно, что это обусловлено способностью микроорганизмов образовывать биопленки не только на живых, но и на абиотических поверхностях. Такой способностью обладают как грамположительные, так и грамотрицательные бактерии.

Биопленки, образуемые комплексом В. cepacia, представляют собой сообщество микроорганизмов, защищенных от многих факторов окружающей среды. Бактерии В. cepacia, участвующие в образовании биопленки, резистентны к антибиотику цефалоспориновой группы — цефтазидиму, и препарату из группы фторхинолонов — ципрофлаксацину, хотя вне биопленки они чувствительны к этим препаратам. Бактерии, находящиеся в биопленке, защищены также от многих факторов окружающей среды. В опытах in vitro показано, что этот процесс не зависит от геномоваров этих штаммов. Образование биопленки обусловлено способностью В. cepacia образовывать АГЛ, и сигнальные молекулы передают информацию между клетками.

Жгутики (флагеллы) и пили выполняют роль структур, необходимых для ранних стадий развития биопленки В. cepacia, способствуя прикреплению клеток и их сцеплению друг с другом. Идентифицирован ряд генов — регуляторов процесса созревания биопленки. Гены были разделены на три класса — (1) кодирующие поверхностные белки, (2) гены, которые включены в биогенные механизмы внешней мембраны и, наконец, (3) гены, кодирующие сигнальные молекулы, связанные с продукцией АГЛ. Сигнальные молекулы, участвующие в образование АГЛ штаммами В. cenocepacia и В. multivorans, придают последним более выраженную способность образовывать биопленки. Оказалось также, что В. cepacia могут создавать биопленки вместе со штаммами Р. aeruginosa, поскольку они совместно колонизируют легкие больных муковисцидозом.

Штаммы В. cepacia способны воспринимать сигналы молекул системы «Quorum sensing», которые вырабатываются клетками Р. aeruginosa, находящимися в биопленках, т. е. имеет место обмен информацией при колонизации ими одного и того же места обитания.

Образование биопленки В. cepacia в легких больных защищает бактерии не только от действия антибиотиков, но также от факторов иммунной защиты организма хозяина. В первом случае создаются условия для образования лекарственно-устойчивых форм инфекции.

в) Патогенез инфекции, вызываемой В. cepacia. Для того чтобы прочно закрепиться в организме хозяина и вызвать инфекцию, бактерии В. cepacia должны внедриться в его ткани и выжить в них. В 1996 г. было показано, что В. cepacia проникают в культивируемые эпителиальные клетки и распространяются в их цитоплазме путем включения в вакуоли, связанные с мембранами. Способность В. cepacia проникать в эукариотические клетки продемонстрирована и на свободно живущих амебах. Этот же феномен выявлен и в отношении макрофагов для штаммов, полученных из внешней среды, равно как и выделенных от больных. Однако первые не размножаются внутри эпителиальных клеток и не выживают в них. По-видимому, внутриклеточное выживание помогает В. cepacia избежать иммунной защиты хозяина.

У больных муковисцидозом с «В. cepacia-синдромом» бурхолдерии обнаруживаются как в экссудате бронхов, так и между эпителиальными клетками. При острой инфекции микроорганизмы обычно локализуются на поверхности воздухоносных путей и в абсцессах. При хроническом течении они распространены диффузно. При переходе в инвазивную форму инфекции штамм В. cepacia, проникая через эпителиальный барьер, вторгается в легочную паренхиму и капилляры, что может привести к бактериемии.

На модели культуры ткани было показано, что штаммы В. cepacia разных геномоваров с целью прохождения через эпителий используют различные пути обхода механических барьеров человека (слизь, реснички эпителия). Так, штамм геномовара III (В. cenocepacia) образует биопленку на апикальной поверхности клеток и внедряется в них путем разрушения гликокаликса и нарушения актинового скелета. Напротив, штаммы геномовара IV (В. stabilis) не образуют биопленок, и бактерии в основном локализуются между клетками эпителия (парацитоз). Штамм геномовара II (В. multivorans) способен проникать сквозь эпителий обоими путями — как через разрушение клетки, так и с помощью парацитоза. Рядом исследователей была выявлена высокая степень корреляции между показателями инвазии В. cepacia в опытах in vitro и in vivo.

- Читать далее "Клиника инфекции Burkholderia cepacia и ее эпидемиология"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 17.4.2020