В настоящей статье приведены прописи приготовления растворов красителей, наиболее употребляемых для окрашивания бактериальных препаратов. Способы окрашивания изложены в отдельных статьях на этом сайте.

Приготовление насыщенных спиртовых растворов красок. В основе приготовления многих красящих растворов лежит предварительное получение насыщенных спиртовых растворов красок, которые готовят следующим образом. Порошки красок в определенном для каждого красителя количестве (указанном ниже) всыпают во флаконы, заливают 96%-ным этиловым спиртом и ставят в термостат при температуре 37°С на 18-24 ч. Периодически содержимое флаконов взбалтывают. В течение указанного времени значительная часть краски растворяется, и на дне флакона остается лишь небольшой осадок.

Насыщенные растворы красок могут храниться долгое время во флаконах темного стекла со стеклянными притертыми или резиновыми пробками.

Приготовление рабочих спиртоводных растворов красок. В небольшое количество насыщенного спиртового раствора краски добавляют дистиллированную воду в разных соотношениях.

а) Метиленовый синий:

1. Метиленовый синий, насыщенный спиртовой раствор:
Метиленовый синий — 8,0-9,0 г
Этиловый спирт 96% (C₂H₅OH) — 100,0 мл

2. Метиленовый синий, спиртоводный раствор:
Пропись 1:
Метиленовый синий, насыщенный спиртовой раствор — 1,0 мл
Вода дистиллированная — 30,0 мл
Пропись 2:
Метиленовый синий — 1,0 г
Этиловый спирт 96% — 10,0 мл
Вода дистиллированная — 100,0 мл

3. Метиленовый синий, водный раствор:
Метиленовый синий — 1,0 г
Вода дистиллированная — 1000,0 мл

Применяется для ориентировочной окраски препаратов, для окраски толстой капли крови. При окраске препаратов по Цилю-Нильсену кислотоустойчивых бактерий дает отчетливо окрашенные клетки, выявляет некислотоустойчивые формы бактерий на общем нежно-голубом фоне.

4. Метиленовый синий, щелочные растворы Леффлера. Щелочные растворы метиленового синего устойчивы и могут храниться во флаконах со стеклянной или резиновой пробкой длительное время, не изменяя своих свойств. Напротив, во время хранения свойства краски даже улучшаются, поэтому она может быть заготовлена на несколько лет.
Пропись 1:
Метиленовый синий, насыщенный 8%-ный раствор — 30,0 мл Вода дистиллированная — 100,0 мл
Калия гидроксид (KOH) 10%-ный раствор — 2 капли
Пропись 2:
Метиленовый синий — 3,0 г
Этиловый спирт 96% — 2,0 мл
Калия гидроксид (KOH) 1%-ный раствор — 1,0 мл
Вода дистиллированная — 100,0 мл

Перемешать в указанном порядке перечисленные ингредиенты. Краска должна пройти период созревания, который длится несколько месяцев. Процесс созревания может быть ускорен путем аэрации раствора. Для этого посуду заполняют краской не более чем наполовину, вместо пробки используют рыхлый ватный тампон. Содержимое флакона следует часто перемешивать.

б) Кристаллический фиолетовый. Кристаллический фиолетовый всегда может быть заменен генциан- или метил-виолетом, поскольку все эти красители относятся к одному классу химических соединений, очень близки по структуре, химической формуле и дают совершенно одинаковый эффект окраски.

1. Кристаллический фиолетовый, насыщенный спиртовой раствор:
Кристаллический фиолетовый — 10,0 г
Этиловый спирт 96% —100,0 мл

2. Кристаллический фиолетовый, спиртоводный раствор:
Насыщенный спиртовой раствор кристаллического фиолетового — 1,0 мл
Вода дистиллированная — 10,0 мл

3. Кристаллический фиолетовый, феноловый раствор:

Пропись 1:
Кристаллический фиолетовый — 1,0 г
Фенол кристаллический — 2,0 г
Этиловый спирт 96% — 10.0 мл
Вода дистиллированная — 100,0 мл

1,0 г фенолового раствора кристаллического фиолетового растирают в фарфоровой ступке с 2,0 г кристаллической карболовой кислоты и несколькими каплями глицерина. Во время растирания небольшими порциями приливают спирт. Когда краска хорошо разотрется, приливают при постоянном помешивании 100 мл дистиллированной воды. Раствор краски фильтруют через влажный бумажный фильтр. Краска нестойкая.

Пропись 2:
Насыщенный спиртовой раствор кристаллического фиолетового — 10,0 мл
Фенол, 2%-ный водный раствор — 100,0 мл
Полученную смесь тщательно взбалтывают и фильтруют через бумажный фильтр. Раствор краски нестойкий, впрок не готовится.

в) Основной фуксин:

1. Фуксин, насыщенный спиртовой раствор:
Фуксин основной — 8,0-9,0 г
Этиловый спирт 96% — 10,0мл

2. Основной фуксин, спиртоводный раствор:
Насыщенный спиртовой раствор фуксина — 1,0 мл
Вода дистиллированная — 10,0 мл
Спиртоводный раствор фуксина нестойкий, поэтому готовят его ex tempore перед окраской препаратов.

3. Основной фуксин Циля феноловый:
Фуксин основной в порошке — 1,0 г
Фенол кристаллический — 5,0 г
Глицерин — 0,5 мл
Этиловый спирт 96% — 10,0мл
Вода дистиллированная — 100,0 мл

1,0 г основного кристаллического фуксина растирают в фарфоровой ступке с 5,0 г кристаллического фенола и несколькими каплями глицерина. Во время растирания фуксина с фенолом небольшими порциями добавляют спирт. После тщательного растирания краски приливают 100,0 мл дистиллированной воды при постоянном помешивании. Раствор краски фильтруют через влажный бумажный фильтр. Фуксин Циля очень стойкий и может храниться длительное время во флаконе темного стекла с притертой пробкой.

4. Феноловый раствор основного фуксина для окраски по Цилю и Нельсену:
Фуксин основной в порошке — 0,3 г
Глицерин — 2-3 капли
Спирт этиловый 96% - 10,0мл
Фенол кристаллический — 5,0 г
Вода дистиллированная до 100,0 мл

Растирают в ступке 0,3 г основного фуксина с 2-3 каплями глицерина, затем по каплям добавляют 10,0 мл этилового спирта, тщательно перемешивая. Расплавляют 5,0 г кристаллического фенола путем легкого подогревания на водяной бане (температура плавления фенола — 41°С) и добавляют слегка подогретую дистиллированную воду до объема 100,0 мл, перемешивают. К 90,0 мл раствора фенола добавляют 10,0 мл приготовленного раствора фуксина. Раствор хранится не более З-х-4-х недель.

5. Фуксин Пфейффера:
Феноловый фуксин Циля — 1,0 мл
Вода дистиллированная — 9,0 мл

Смесь в течение нескольких минут энергично встряхивают. Полученный раствор краски очень нестойкий, поэтому его готовят в небольших количествах только для работы на текущий день.

г) Красители и реагенты для окрашивания по Граму в модификации Г.П. Калины:

1. Бриллиантового зеленого спиртовой раствор:
Бриллиантовый зеленый — 0,5 г
Этиловый спирт 96% — 100,0 мл

Краска хранится длительное время во флаконе темного стекла в темноте, закрытая стеклянной притертой или резиновой пробкой.

2. Основной раствор для окраски по Граму в модификации Г. П. Калины:
Фуксина основного 5%-ный спиртовой раствор — 2,0 мл
Йода кристаллического 5%-ный спиртовой раствор — 2,0 мл
Йодида калия (KI) 0,5%-ный спиртовой раствор — 96,0 мл

0,5%-ный раствор йодида калия готовят при подогревании на водяной бане. После полного растворения навески йодида калия в 96% этиловом спирте этот раствор соединяют с растворами фуксина и йода. Полученную смесь хранят во флаконе темного стекла с притертой пробкой в холодильнике.

д) Приготовление красящих бумажек по Синеву. Краситель, предназначенный для пропитывания бумаги, наливают в лоток или глубокую тарелку. Бумагу нарезают полосками шириной 2-2,5 см и длиной 30-50 см. Полоску погружают на несколько секунд в краситель так, чтобы окрашивались обе поверхности. Окрашенные полосы вынимают пинцетом, дают красителю стечь, подвешивают на веревке для высушивания. Бумагу сушат на воздухе при комнатной температуре или в термостате при 37-50°С. Высушенные полоски бумаги разрезают на кусочки размером 2x2 или 2x2,5 см.

е) Прописи растворов красителей для приготовления бумаги:

1. Кристаллический генциановый или метиловый фиолетовый для окраски по Граму:
Кристаллический фиолетовый — 1,0 г
Этиловый спирт 96% — 100,0 мл
Глицерин — 5,0 мл

2. Фуксин основной:
Фуксин — 2,0 г
Этиловый спирт 96% — 100,0 мл
Глицерин — 1,0 мл

3. Фуксин карболовый Циля. Пропись обычная; на 100 мл приготовленного красителя добавляют 1-2 мл глицерина.

ж) Краска Романовского-Гимзы (коммерческая). Краска Романовского-Гимзы представляет собой сочетание органического красителя азура, получаемого из метиленового синего при воздействии на него щелочных растворов, с эозином и метиленовым синим.

Сухую краску Романовского-Гимзы растворяют в смеси равных весовых частей метилового спирта и глицерина. Раствор помещают на 18-20 ч в термостат или на 4-6 ч на водяную баню при температуре 60°С.

Непосредственно перед употреблением краску разводят из расчета 1-3 капли на 1 мл дистиллированной воды pH 6,8-7,0. Изменение pH может привести к искажению результатов окраски или выпадению осадка, лишающего раствор способности окрашивать. Для получения точных результатов лучше всего использовать буферные фосфатные растворы, разбавляя их дистиллированной водой в 10-20 раз.

- Читать далее "Состав растворов Олсвера и Люголя"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 23.2.2020