а) Мясная вода. Парную говядину или конину освобождают от костей, жира, сухожилий, пропускают через мясорубку. К 1,0 кг полученного фарша добавляют 2000,0 мл водопроводной воды, настаивают 12-24 ч в холодном месте, затем осторожно кипятят в течение 1 ч, накипь снимают. После кипения мясную воду остужают для застывания жира, который легко удаляют, затем фильтруют через ватно-марлевый фильтр до полной прозрачности, после чего доливают водопроводной водой до первоначального объема.

Мясная вода может быть заменена плацентарной водой, которую готовят следующим образом. Свежую промытую и освобожденную от оболочки человеческую плаценту пропускают через мясорубку. Фарш заливают двойным объемом воды, кипятят в течение 30 мин, фильтруют, разливают в бутыли.

Полученную таким образом мясную воду стерилизуют в бутылях, закрытых ватно-марлевыми пробками, 20 мин при температуре 121°С или дробно текучим паром. Стерильная мясная вода, являющаяся основой для приготовления многих питательных сред, сохраняется длительное время. Можно обойтись без стерилизации и хранить мясную воду с хлороформом (1-2% об/об) под резиновой или плотной корковой пробкой, обернутой полиэтиленом.

б) Пептонная вода. Пептонную воду используют для культивирования нетребовательных микроорганизмов, а также в качестве основы среды для изучения ферментации углеводов и образования индола.

Состав:
Пептон — 10,0-20,0 г
Натрия хлорид NaCl — 5,0 г
Вода дистиллированная — 1000,0 мл

Навеску сухой смеси растворяют в 1000,0 мл дистиллированной воды. Устанавливают необходимое значение pH, кипятят 30 мин, фильтруют через бумажный фильтр до полной прозрачности. Стерилизуют при температуре 121°С 10 мин.

в) Мясопептонный бульон (МПБ). МПБ используют для выращивания неприхотливых микроорганизмов и как основу для приготовления сложных селективных и дифференциально-диагностических сред.

Состав:
Пептон — 10,0-20,0 г
Натрия хлорид — 5,0 г
Вода мясная — 1000,0 мл
pH 7,2±0,2

Смесь указанных в рецепте ингредиентов кипятят в течение 30 мин, после чего доводят уровень воды до первоначального объема. Фильтруют через бумажный фильтр. Окончательно устанавливают требуемую величину pH насыщенным раствором натрия гидрокарбоната или 10%-ным раствором натрия гидроксида.

Стерилизуют при температуре 121°С 15-20 мин. После стерилизации в МПБ может выпасть осадок, поэтому бульон фильтруют вторично и снова стерилизуют. Вторичную стерилизацию производят при более низкой температуре — для предотвращения выпадения осадка.

г) Мясопептонный агар (МПА). МПА применяют для выращивания неприхотливых микроорганизмов и как основу для приготовления плотных специальных сред для культивирования более требовательных микробов (сывороточного, кровяного агара и др.).

Состав:
Пептон — 10,0 г
Натрия хлорид — 5,0 г
Вода мясная — 1000,0 мл
Агар - 1,0-20,0 г
pH 7,3±0,2

Смесь кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения добавленных ингредиентов. Бульон фильтруют, устанавливают pH и добавляют измельченный агар (в зависимости от качества агара и назначения среды). После добавления агара среду кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения агара. При помутнении среды ее просветляют одним из известных способов.

Приготовленную среду разливают в пробирки или флаконы, стерилизуют в автоклаве при 121 °С в течение 20 мин.

д) Питательный бульон (сухая среда) HiMedia, Nutrient Broth. Питательный бульон предназначен для выращивания и изучения культуральноморфологических свойств чистых культур микроорганизмов.

Состав, г/л:
Пептон — 5,0
Натрия хлорид — 5,0
Экстракт говяжий — 1,5
Дрожжевой экстракт — 1,5
pH 7,4±0,2

Суспендируют 13,0 г сухой смеси в 1000,0 мл дистиллированной воды. Кипятят до полного растворения внесенных ингредиентов. Стерилизуют при 121°С в течение 15 мин.

Среду используют для выращивания неприхотливых микробов. Добавление крови, сыворотки и других ингредиентов делает ее пригодной для роста требовательных микроорганизмов.

е) Сухой питательный бульон (сухая среда), НПО «Питательные среды». Сухой питательный бульон используют для выращивания и изучения культурально-морфологических свойств микроорганизмов различных таксономических групп, а также в качестве питательной основы для приготовления сред специального назначения.

Состав, г/л:
Гидролизат кильки панкреатический — 10,05
Натрия хлорид — 4,95
pH 7,2±0,2

Препарат в количестве, указанном на этикетке, размешивают в 1000,0 мл дистиллированной воды. Кипятят 1-2 мин, фильтруют через бумажный фильтр. Разливают во флаконы или пробирки. Стерилизуют при 121°С в течение 20 мин.

ж) Питательный агар (сухая среда) HiMedia, Nutrient Agar. Питательный агар рекомендуют использовать для выращивания широкого спектра микроорганизмов, не требующих специальных питательных добавок.

Состав, г/л:
Пептон — 5,0
Натрия хлорид — 5,0
Экстракт говяжий — 1,5
Экстракт дрожжевой — 1,5
Агар — 15,0
pH 7,4±0,2

Суспендируют 28,0 г сухой смеси в 1000,0 мл дистиллированной воды. Кипятят при постоянном помешивании до полного растворения внесенных ингредиентов. Стерилизуют при 121°С в течение 15 мин.

з) Питательный полужидкий агар. Среда предназначена для изучения характера роста и подвижности широкого спектра микроорганизмов.

Состав, г/л:
Мясная вода — 1000,0 мл
Пептон — 5,0
Агар — 3,0-8,0 г
pH 7,2±0,1

Навеску сухой смеси суспендируют в 1000,0 мл мясной воды. Нагревают на слабом огне до полного растворения всех ингредиентов. Среду доводят до кипения, кипятят 1-2 мин. При необходимости фильтруют. Устанавливают pH. Среду разливают по пробиркам. Стерилизуют при 121°С в течение 20 мин.

и) Триптический перевар Хоттингера. Говяжье мясо освобождают от костей, жира, сухожилий, нарезают мелкими кусочками, взвешивают и опускают в кипящую воду из расчета 1 кг мяса на 1000,0 мл воды. Мясо кипятят в течение 15-20 мин, затем вынимают и пропускают через мясорубку. Бульон смешивают с фаршем и сливают в бутыль с таким расчетом, чтобы 1,5 бутыли оставалась свободной. К горлышку бутыли подбирают хорошо пригнанную резиновую пробку.

Смесь подщелачивают 20%-ным раствором питьевой соды до pH 7,9±0,1, прибавляют очищенную от жира, соединительной ткани и дважды пропущенную через мясорубку поджелудочную железу в количестве 10% от имеющегося объема (на 1000,0 мл жидкости 100,0 г железы). Вместо поджелудочной железы можно добавить панкреатин в количестве 0,5% и более в зависимости от его активности. Через 1-2 ч после добавления фермента проверяют реакцию перевара и подщелачивают его повторно до pH 7,4±0,1. Отсутствие сдвига реакции смеси в сторону окисления после добавления фермента указывает на недоброкачественность последнего.

Содержимое бутыли тщательно перемешивают, добавляют хлороформ из расчета 10,0-30,0 мл на каждый литр перевара. Бутыль плотно закрывают резиновой пробкой и ставят в термостат при 37°С на 7-10 сут.

В течение первого дня содержимое бутыли перемешивают вначале каждые 15-20 мин, затем через 2-3 ч, а в последующие дни — по нескольку раз в день, открывая при этом пробку для выхода избытка паров хлороформа.

При стоянии в термостате мясо ферментируется, превращаясь в однородный осадок серовато-желтого цвета, а жидкость из мутно-серой становится прозрачной соломенно-желтого цвета. Об окончании переваривания судят по образованию триптофана, обнаруживаемого следующим образом: в пробирку наливают 3-4 мл фильтрованного перевара, добавляют 3-4 капли бромной воды. При наличии триптофана жидкость приобретает розово-фиолетовый цвет.

Приготовление бромной воды. На 100,0 мл дистиллированной воды берут 3-3,5 мл чистого брома для получения насыщенного раствора. Хранят в склянке темного стекла (не на свету).

По окончании гидролиза перевар фильтруют через бумажный фильтр, определяют содержание аминного азота.

Аминный азот — суммарное количество свободных аминокислот в гидролизате белка. При описанном способе переваривания гидролизат содержит не менее 5,0-7,0 г/л аминного азота.

Перевар разливают в бутыли и стерилизуют 30 мин при температуре 120°С.

Триптический перевар Хоттингера содержит смесь продуктов распада белков, образующихся при гидролизе мышечной ткани ферментами поджелудочной железы.

Действие ферментов приводит к полному гидролизу белка. В результате этого образуются пептоны, представляющие собой смесь пептидов и аминокислот, которые для микроорганизмов служат основным источником азота, фосфора, серы, витаминов и других веществ, необходимых для их роста.

При ферментном гидролизе, более мягком по сравнению с кислотным, по-видимому, в осколках пептидов сохраняются лабильные факторы роста. Многие микроорганизмы более активно размножаются на питательных средах, содержащих пептиды, которые усваиваются лучше, чем отдельно взятые аминокислоты или коммерческие препараты, содержащие менее гидролизованные продукты белка, чем пептоны. Среды, приготовленные на триптическом переваре Хоттингера, более питательны, чем среды на пептонной или мясной воде с добавлением говяжьего и дрожжевого экстрактов.

к) Бульон на основе перевара Хоттингера. Питательный бульон предназначен для выращивания и изучения чистых культур широкого спектра микроорганизмов.

Основной перевар Хоттингера разводят водопроводной или дистиллированной водой до содержания аминного азота (г/л), оптимального для определенной группы микроорганизмов. Для неприхотливых бактерий достаточно 1,0-1,2 г/л аминного азота. Для более прихотливых (анаэробы, нейссерии, стрептококки и др.) этот показатель устанавливают в пределах 1,5-1,7 г/л. К разведенному перевару добавляют 0,5% натрия хлорида, устанавливают pH 7,3+0,1 и кипятят 15-20 мин.

Приготовленный таким образом бульон фильтруют через ватно-марлевый или бумажный фильтр, разливают во флаконы и пробирки и стерилизуют при 121°С 20-30 мин.

л) Агар на основе перевара Хоттингера. Плотная среда предназначена для культивирования, выделения и изучения свойств микроорганизмов различных таксономических групп.

В бульон Хоттингера, подогретый до температуры 50-60°С, вносят мелко нарезанный хорошо промытый агар из расчета (по мере необходимости) 15,0-25,0 г на 1000,0 мл. Периодически помешивая, смесь доводят до кипения для полного растворения агара. В горячем состоянии среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают во флаконы или колбы, стерилизуют в автоклаве 30 мин при температуре 121 °С. Для использования расплавляют в водяной бане и разливают в чашки Петри и пробирки.

м) Основной пептон Мартена. Свиные желудки тщательно очищают от пленок, жира и грубого содержимого, не промывая внутренней части; разрезают на куски и пропускают через мясорубку. Полученный фарш помещают в бутыли, доливают водопроводной водой, подогретой до температуры 50°С (на 250,0 — 500,0 г фарша — 1000,0 мл воды), а затем добавляют 10,0 мл химически чистой соляной кислоты (уд. вес 1,19).

Содержимое бутыли хорошо перемешивают и ставят на сутки в термостат при 37-42°С. Первые 6-7 ч бутыль периодически встряхивают, а затем дают жидкости отстояться, не закрывая бутыль пробкой. К концу вторых суток жидкость окрашивается в интенсивно-желтый цвет и вместо крупного фарша на дне бутыли образуется небольшое количество гомогенного, похожего на желтый песок, осадка. Надосадочный слой полученного таким образом основного пептона Мартена осторожно сливают, прогревают при температуре 80"С в течение 10 мин для прекращения действия ферментов в водяной бане.

Пептон Мартена сохраняют с хлороформом или стерилизуют текучим паром 30 мин, хранят в сухом и прохладном месте. Употребляют не ранее, чем через 5 сут. после приготовления.

н) Бульон Мартена. Бульон предназначен для выращивания и изучения свойств бактерий различных таксономических групп.

Накануне приготовления бульона готовят мясную воду (см. рецепт). Затем смешивают равные количества мясной воды и пептона Мартена. Смесь кипятят 10 мин, подщелачивают 10%-ным раствором едкого натра до pH 8,1 ±0,1, добавляют 0,5% ацетата натрия, кипятят 5 мин, фильтруют и разливают в пробирки или флаконы. Бульон Мартена стерилизуют дробно текучим паром 2 дня подряд по 40 мин.

и) Агар Мартена. Среда предназначена для культивирования и изучения свойств широкого спектра микроорганизмов.

В бульон Мартена, подогретый до температуры 50-60°С, опускают мелко нарезанный промытый агар из расчета 25,0 г на 1000,0 мл, периодически помешивая, доводят до кипения для полного растворения агара. В горячем состоянии среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в требуемые емкости и стерилизуют в автоклаве 30 мин при температуре 121°С.

к) Сахарный бульон (бульон с глюкозой). Бульон предназначен для выращивания грамположительных кокков.

К МПБ с pH 7,4±0,2 прибавляют глюкозу в количестве 0,5-1,0%. Перед добавлением глюкозу растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. Приготовленную среду стерилизуют 3 дня подряд текучим паром по 30 мин или однократно в автоклаве при 115°С в течение 30 мин. Глюкозу можно добавлять ex tempore, используя 40%-ный стерильный раствор глюкозы.

л) Сахарный агар (агар с глюкозой). Среда предназначена для выращивания грамположительных кокков.

К расплавленному МПА добавляют от 0,5 до 2% глюкозы, предварительно растворенной в небольшом количестве дистиллированной воды. Приготовленную среду стерилизуют текучим паром дробно 3 дня подряд по 20 или 15 мин при температуре 115°С в автоклаве. Глюкозу можно добавлять ex tempore, используя 40%-ный стерильный раствор глюкозы.

- Читать далее "Среды для гемокультур бактерий"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 23.2.2020