Для определения количества нитрифицирующих бактерий в почве удобно применять метод предельных разведений. При этом целесообразно использовать элективную среду Виноградского, в которой можно одновременно определить обе фазы нитрификации: окисление аммиака до нитритов и последующее окисление азотистой кислоты до азотной. Поскольку нитрификаторы автотрофы, то единственным источником углерода в такой среде является СO₂, входящий с состав воздуха и мела. Энергетический материал и источник азота — аммиак и соли аммония, а также нитрит, образующийся из NH₄⁺.

Для работы обычно используют колбы, объемом около 50 мл, содержащие по 10-15 мл среды каждая. Высота среды в колбах должна быть не более 1-1,5 см, так как нитрифицирующие бактерии являются строгими аэробами. Колбы засевают, внося в каждую из них по 1 мл посевного материала из разных почвенных разведений. Посев производят из разведений от 10^-1 до 10^-5 в пятикратной повторности.

Две колбы со стерильной средой оставляют для контроля реактивов при выявлении нитратов и нитритов в культурах и для контроля чистоты среды. Посевы культивируют 2-3 недели при 28-30 °С.

О развитии нитрификаторов судят по появлению в среде нитритов и нитратов. Их образование рекомендуется проверять на 5-7-й день после посева и вторично — на 14-15-й. Для выявления нитритов и нитратов проводят соответствующие качественные реакции. Перед анализом культур обязательно проводят контрольные реакции со стерильной средой.

а) Реакция на нитраты с дифениламином. На фарфоровую пластинку наносят каплю концентрированной серной кислоты, помещают в нее несколько кристаллов дифениламина и после его растворения добавляют каплю исследуемой жидкости. При наличии ионов NO₃ жидкость окрашивается в темно-синий цвет. Следует иметь в виду, что азотистая кислота также дает с дифениламином синее окрашивание. Поэтому пробу на нитраты можно проводить только при отсутствии в среде нитритов.

б) Крахмал-йодная реакция на нитриты основана на том, что нитриты в кислой среде окисляют йодистый цинк с выделением йода, присутствие которого обнаруживают при помощи крахмала. Для проведения реакции к капле культуральной жидкости добавляют каплю раствора, содержащего ZnCl₂, KI и крахмал, и каплю раствора НС1. При наличии в среде нитритов появляется синее окрашивание.

в) Реакция на нитриты с реактивом Грисса основана на образовании в кислой среде в присутствии нитритов и ароматических аминов (сульфофеноловой кислоты и а-нафтиламина) азосоединения, окрашенного в красно-розовый цвет. Для проведения реакции к капле реактива Грисса добавляют каплю культуральной жидкости. Появление красного окрашивания свидетельствует о присутствии нитритов. Параллельно проводят реакции со стерильной средой.

Таким образом можно установить титр нитрифицирующих бактерий в исследуемой почве. При необходимости наиболее вероятное число нитрификаторов в 1 г исходного субстрата рассчитывают с использованием таблиц Мак-Креди.

- Читать далее "Определение аммонифицирующих бактерий в почве"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 29.09.2019