Определение окислительно-восстановительных ферментов бактерий

Окислительно-восстановительные реакции, лежащие в основе метаболических процессов, обеспечивающих жизнеспособность всех без исключения животных, растительных организмов и бактериальных клеток, протекают с участием двух субстратов (окисляемого и восстанавливаемого). Окисление характеризуется отщеплением атомов водорода (протонов) или электронов от субстрата-донора, восстановление-присоединением протонов или электронов к субстрату-акцептору. Ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции, объединяют в один класс оксидоредуктаз. Различают следующие основные оксидоредуктазы: аэробные оксидазы (гидрогеназы), анаэробные дегидрогеназы и цитохромоксидазы.

• Аэробные оксидазы катализируют перенос протонов или электронов с окисляемого субстрата непосредственно на конечный акцептор — кислород воздуха. Определение оксидазы используется в микробиологии для идентификации аэробных бактерий.

• Анаэробные дегидрогеназы участвуют в реакциях, в которых протоны или электроны переносятся с одного компонента окисляемой цепи на различные неорганические соединения — сульфиты, карбонаты, нитриты, нитраты, серу, железо (III) и пр.

• Цитохромоксидазы катализируют перенос только электронов. Последние на цитохромоксидазу передаются цитохромами — сложными железосодержащими белками, простетическая (небелковая) группа которых представлена гемом. Цитохромы содержатся в животных, растительных клетках, факультативно-анаэробных микроорганизмах.

В телах микробных клеток цитохромы локализуются в периплазматическом пространстве между внутренней поверхностью пептидогликанового слоя и плазматической мембраной. Все цитохромы способны принимать и отдавать электроны путем обратимого изменения валентности атомов железа, входящих в состав гема. Механизм переноса состоит в том, что электроны от субстрата воспринимаются окисленным ионом железа, содержащимся в простетической группе этого фермента. Железо восстанавливается (Fe → )Fe2+), а затем электрон передается молекулярному кислороду, и при взаимодействии его с ионами водорода образуется молекула воды.

1. Оксидазные тесты. Оксидазные тесты используют для дифференциации представителей родов Neisseria, Alcaligenes, Aeromonas, Vibrio, Campylobacter, Pseudomonas, обладающих оксидазной активностью, и оксидазоотрицательных Enterobacteriaceae.

Тест основан на том, что у некоторых бактерий биологическое окисление в целях получения энергии осуществляется при помощи цитохромоксидазы либо индофенолоксидазы — железосодержащего белка гемопротеина, который катализирует перенос электронов от вещества-донора (например, НАД-Н) к веществам реципиентам (обычно к O2). Для того чтобы этот процесс получил визуальное выражение, пользуются методами Ковача или Gaby-Hadley, основанными на введении в питательную среду искусственных бесцветных реагентов в восстановленном состоянии, которые в присутствии микробной оксидазы окисляются и приобретают соответствующую им окраску.

Техника постановки теста. Оба метода могут быть воспроизведены в двух вариантах:
- в прямом с нанесением одного из реактивов непосредственно на колонии исследуемой культуры, помещенные в чашки Петри;
- в непрямом, при котором из материала исследуемой культуры платиновой петлей, запаянной пипеткой Пастера или заостренной стерильной палочкой делают мазок на полоске фильтровальной бумаги, пропитанной одним из реактивов.

Метод Ковача (вариант 1). Для постановки теста используют 16-18-часовую культуру испытуемого микроорганизма, выращенного в чашках Петри на МПА*. Свежеприготовленный реактив Ковача по 1-2 капли наносят пастеровской пипеткой или стерильным дозатором на поверхность изолированных колоний либо несколько миллилитров этого реактива наливают на поверхность среды и, осторожно покачивая чашку, распределяют реактив тонким слоем по всей площади.

P.S. *Здесь и далее рецепты красителей, индикаторов, буферных растворов, реактивов и питательных сред для постановки биохимических тестов см. в одноименном разделе, завершающем часть I.

При контакте с тетраметил-п-фенилендиамином (реактив Ковача) колонии, продуцирующие цитохромоксидазу, в ближайшие 10-30 с из бесцветных превращаются в темно-фиолетовые вследствие образования соединения вурстеровского синего.

Метод Ковача (вариант 2). Полоску фильтровальной бумаги помещают на дно чашки Петри с реактивом Ковача и пропитывают ее до влажного состояния. Затем на влажную бумагу платиновой петлей или запаянной пипеткой Пастера наносят исследуемую микробную культуру в виде мазка для микроскопии или штриха. Оксидазоположительные культуры через 20-30 с приобретают темно-синюю окраску, оксидазотрицательные — сохраняют исходный цвет.

Метод Gaby-Hadley. Техника постановки цитохромоксидазного теста методом Gaby-Hadley отличается от описанного выше метода Ковача только тем, что для выявления цитохромоксидазы используют реактив Gaby-Hadley, выполняющий роль искусственного акцептора электронов.

В присутствии цитохромоксидазы N, N-диметил-фенилендиамин с α-нафтолом (компонентом реактива Gaby-Hadley) образуют соединение индофенол синий. Цитохромоксидазные колонии и мазки, приготовленные из них, на фильтровальной бумаге в течение первой минуты окрашиваются в отчетливо синий цвет.

Примечание. При постановке теста на цитохромоксидазу посев исследуемых культур должен выполняться платиновыми, пластиковыми петлями или запаянными пастеровскими пипетками, так как на железной или нихромовой проволоке образуются окислы железа, которые могут привести к получению ложноположительных результатов. По этой же причине рекомендуется для получения дистиллированной воды пользоваться стеклянным дистиллятором.

Определение окислительно-восстановительных ферментов бактерий

2. Тест с лакмусовым молоком. Используется для выявления отдельных реакций метаболизма при дифференциальной диагностике и идентификации патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

При выращивании микроорганизмов в лакмусовом молоке выявляются различные ферментативные реакции:
— ферментация лактозы, сопровождающаяся образованием различных кислых продуктов реакции, ведущая к смещению pH в кислую зону с приобретением средой розового цвета;
— накопление достаточного количества кислоты в среде (связанное с расщеплением лактозы), сопровождающееся коагуляцией казеина с формированием казеинового сгустка;
— синтез протеолитических ферментов культивируемыми бактериями, приводящий к пептонизации казеина и превращению молока в соломенно-желтую мутную жидкость, напоминающую сыворотку;
— при активном образовании растущими бактериями декарбоксилаз, которые вступают в реакции с аминокислотами, образующими казеин, в среде накапливаются амины, pH смещается в щелочную зону с окрашиванием среды в выраженный голубовато-синий цвет;
— некоторые микроорганизмы, не вызывая существенного изменения pH среды, редуцируют лакмус, в результате чего среда обесцвечивается без изменений каких-либо других первоначальных ее свойств;
— при культивировании в лакмусовом молоке биохимически инертных бактерий никаких изменений в реакции среды и соответственно первоначального ее цвета не происходит.

Тест основан на комплексе ферментативных реакций, проявлению которых соответствуют характерные изменения первоначальных свойств питательной среды.

Техника постановки теста. Пробирки с лакмусовым молоком — средой Минкевича засевают 18-часовой исследуемой культурой с плотной или жидкой питательной среды. Посевы инкубируют в термостате при температуре 36(±1)°С в течение 7-10 дней, ежедневно наблюдая за изменениями свойств среды.

Учет результатов. Результаты изменения среды отмечают в протоколе исследования, пользуясь следующими обозначениями:
Н — рост бактерий, не сопровождающийся изменением реакции среды и, следовательно, изменением ее цвета;
К — кислотообразование в среде с четко выраженным ее порозовением;
НК — слабовыраженное кислотообразование, вызывающее изменение оттенка среды, улавливаемое только при сопоставлении опытной пробирки с контрольной (незасеянная среда);
Щ — щелочеобразование, сопровождающееся четко выраженным посинением среды;
НЩ —слабовыраженное щелочеобразование, вызывающее изменение оттенка среды, улавливаемое только при сопоставлении ее с цветом контрольной пробирки;
Р — редукция лакмуса, проявляющаяся полным обесцвечиванием лакмуса.

3. Тест на редукцию метиленового синего. В окисленном состоянии метиленовый синий используется при окраске микроскопических препаратов. При восстановлении краситель обесцвечивается, утрачивая свойства красящего вещества.

Редуцирующая активность в отношении метиленового синего используется в качестве дифференциально-диагностического теста при идентификации энтерококков и других видов условно-патогенных микроорганизмов.

Тест основан на способности молока, представляющего собой питательный субстрат для культивируемых микроорганизмов, при введении в него метиленового синего приобретать интенсивный голубой цвет и обесцвечиваться при росте в нем микроорганизмов с редуцирующей способностью в отношении метиленового синего.

Техника постановки теста. В пробирки с 5 мл молока с метиленовым синим засевают петлей 18-часовую бактериальную культуру с плотной питательной среды или 0,1 мл бульонной культуры. Результат реакции учитывают через 24 ч после инкубации посевов в термостате при температуре 36,5(+0,5) °С.

Учет результатов. При положительном результате редукции метиленового синего молоко приобретает кремовый цвет. Реакция отмечается буквой «р». При слабоположительной реакции среда имеет светло-зеленую окраску. Реакция обозначается р±. При отрицательном результате цвет реакции остается без изменений.

Положительный контроль: Е. faecalis, Е. faecium.

Отрицательный контроль: Streptococcus spp.

Классификация ферментом микроорганизмов

4. Тест на редукцию ТТХ (2,3,5-трифенилтетразолия хлорида C19H15ClN4). Используется для дифференциальной диагностики энтерококков и других микроорганизмов.

Тест основан на восстановлении 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида — бесцветного химического соединения, до трифенилформазана, который в органических растворителях и под действием продуктов жизнедеятельности некоторых видов микроорганизмов, в частности энтерококков, восстанавливается и приобретает вишневую окраску.

Техника постановки теста. Исследуемую 18-часовую агаровую или бульонную культуру микроорганизмов высевают штрихами на питательную среду с ТТХ. Посевы инкубируют при 36(±1) °С в течение 24 ч.

Учет результатов. Колонии микроорганизмов, восстанавливающих ТТХ (ТТХ+), имеют на чашке вишнево-красный цвет. Колонии (ТТХ-), не редуцирующие ТТХ или имеющие слабую редукционную активность, образуют бесцветные колонии или с неярко выраженным розоватым оттенком.

Положительный контроль: Е. faecalis.

Отрицательный контроль: Е. faecium.

5. Тест на каталазу. Каталаза (греч. katalisys — разрушение) — фермент, способствующий расщеплению перекиси водорода на воду и молекулярный кислород.

2O2 → 2Н2O + O2

В клетках бактерий фермент образуется в процессе биохимического окисления, поэтому обнаружить его можно только в молодых жизнедеятельных культурах.

Тест на каталазу в практике микробиологических исследований используется очень широко для дифференциации и идентификации ряда патогенных и условно-патогенных бактерий.

Процесс образования каталазы может происходить в широком температурном диапазоне (+15... +40 °С) при значениях pH от 4,5 до 9,0. Тем не менее при постановке теста на определение каталазы инкубацию посевов проводят традиционно при 36(±1) °С, а каталазную активность принято определять при исходно нейтральном значении pH в условиях комнатной температуры (+20 ... +22 °С).

Тест основан на том, что с первых же секунд контакта перекиси водорода с каталазой начинается ее расщепление, сопровождающееся более или менее интенсивным выделением пузырьков кислорода.

Техника постановки реакции и учет результатов. Чистую 18-20-часовую культуру идентифицируемого микроорганизма высевают на чашки Петри или в пробирки на питательный мясопептонный либо сахарный агар. Питательные среды, содержащие кровь человека или животных, для постановки каталазного теста не применяются в связи с возможностью получения ложноположительных результатов из-за каталазной активности форменных элементов крови.

Посевы инкубируют при 36(±1)°С не более суток. Для выявления каталазы у выделенных культур предложено 2 способа:

Способ 1. На поверхность выращенной в чашке Петри или пробирке микробной культуры наносят тест-реактив — свежеприготовленный 3% раствор перекиси водорода с таким расчетом, чтобы он тонким слоем покрыл поверхность культуры.

Способ 2. На чистое, хорошо обезжиренное предметное стекло наносят каплю свежеприготовленного 3% раствора перекиси водорода и эмульгируют в ней 1 петлю исследуемой культуры.

При наличии каталазы в микробной культуре на поверхности среды или в капле раствора перекиси водорода на предметном стекле в первые же 2-3 с появляются пузырьки кислорода. Газообразование может быть бурным или умеренным. Независимо от его интенсивности реакция учитывается как положительная.

Появление единичных пузырьков или наступление газообразования в более отдаленные сроки (13-15 с) расценивается как реакция сомнительная, требующая повторной постановки.

Отсутствие газообразования или появление одиночных пузырьков газа через продолжительное время после добавления реактива определяется как реакция отрицательная.

Контроль положительный: Pseudomonas spp., Proteus spp.

Контроль отрицательный: Streptococcus spp., Clostridium spp.

- Читать далее "Углеводы для дифференциальной диагностики и идентификации различных микроорганизмов"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 22.05.2019

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.