а) Буферный угольно-дрожжевой агар (вариант среды BCYEα). Состав:
Дрожжевой экстракт — 10,0 г
Активированный уголь — 2,0 г
L-цистеин — 0,4 г
Пирофосфат железа растворимый — 0,25 г
ACES -буфер — 10,0 г
Агар — 15,0 г
α-Кетоглутаровая кислота — 0,25 г
Дистиллированная вода — 980,0 мл

Все компоненты среды кроме L-цистеина и растворимого пирофосфата железа, добавляют к 980,0 мл дистиллированной воды, растворяют и доводят pH до 6,9 при помощи 1N раствора КОН. Среду автоклавируют 15 мин при температуре 121°С, затем охлаждают до 50°С в водяной бане и добавляют свежеприготовленные растворы L-цистеина (0,4 г в 10,0 мл дистиллированной воды) и пирофосфата железа (0,25 г в 10,0 мл дистиллированной воды), профильтрованные через мембранный фильтр (0,3 мкм).

Для ингибирования роста посторонней микрофлоры в среду добавляют селективную добавку, содержащую на 1,0 мл среды 4 мкг цефамандола, 80 ЕД полимиксина В и 8 мкг анизомицина.

Среду быстро разливают в чашки, слегка взбалтывая флакон для равномерного распределения угля. Разлитая среда хранится в пластиковых или металлических контейнерах в холодильнике не более 2 нед. Чашки инкубируют при температуре 35°С в атмосфере 2,5% CO₂ и влажности около 65%.

Различные варианты коммерческих сред готовят в соответствии с прописью фирмы-производителя («Oxoid», «BioMerieux», «HiMedia»).

б) Основа агара для легионелл, HiMedia, Legionella Agar Base. Агар с добавками используют для выделения легионелл из клинического материала и различных водных источников.
Состав основы, г/л:
Экстракт дрожжевой - 10,0
Уголь активированный - 1,5
ACES-буфер - 6,0
α-Кетоглутарат - 1,0
Калия гидроксид - 1,5
Агар - 17,0
pH 6,0±0,2

Суспендируют 18,5 г среды в 500,0 мл дистиллированной воды. До стерилизации не нагревают! Стерилизуют автоклавированием при 121°С. Охлаждают до 50°С. Соблюдая правила асептики, добавляют один флакон ростовой добавки (FD-016) и хорошо перемешивают.

Чтобы сделать среду селективной, добавляют 1 флакон селективной добавки FD-017, хорошо перемешивают и разливают в чашки Петри. Посевы на этой среде инкубируют с 5% диоксида углерода (CO₂) во влажной атмосфере. Чашки исследуют в первые, на третьи и пятые сутки, при отсутствии роста оставляют до 14 сут.

Колонии мелкие (диаметром 1-1,5 мм) от светло-серого до голубоватого цвета, со временем белеют.

A. Ростовая добавка для легионелл (FD-016), HiMedia Legionella Growth Supplement. Добавка содержит важные дтя роста легионелл вещества в стерильной лиофилизированной форме. Состав, мкг/л:
Хлорид L-цистеина — 400,0
Железа пирофосфат — 250,0
Натрия селенит — 10,0

После добавления 5,0 мл стерильной дистиллированной воды содержимое одного флакона добавки переносят в 500,0 мл стерильной расплавленной основы для легионелл Legionella Agar Base.

B. Селективная добавка для легионелл (FD-017), HiMedia Lefionella Selective Supplement. Добавка предотвращает рост посторонней микрофлоры. Состав:
Колистина сульфат — 15 ЕД/мл
Ванкомицин — 5,0 мкг/мл
Триметоприм — 2,5 мкг/мл
Амфотерицин В — 2,5 мкг/мл

Содержимое флакона регидратируют в 1,0 мл этилового спирта с 1,0 мл дистиллированной воды. Полученный раствор добавляют к 500,0 мл основы среды для легионелл.

в) Легионеллбакагар. Коммерческая питательная среда для культивирования легионелл, сухая (ФГУН ГНЦ Прикладной микробиологии, г.Оболенск). Состав, г/л:
Гидролизат рыбной муки сернокислотный марки ФК — 10,0
Стимулятор роста гемофильных микроорганизмов — 10,0
L-цистеина гидрохлорид — 0,4
Агар — 12±2,0
pH 6,9±0,1

Навеску основы, указанную на этикетке (31,5±1,5 г), размешивают в 1000,0 мл дистиллированной воды, стерилизуют при температуре 121°С в течение 20 мин. Стерильную среду охлаждают до температуры 50-55°С.

Навеску 0,4 г L-цистеина гидрохлорида растворяют в 10,0 мл дистиллированной воды и стерилизуют в течение 30 минут при температуре 112°С.

К охлажденному раствору основы асептически добавляют стерильный раствор L-цистеина гидрохлорида, перемешивают и разливают готовую среду в стерильные чашки Петри и пробирки.

Колонии легионелл обнаруживают на среде после 72 ч инкубации в термостате. Колонии круглые, гладкие, выпуклые, светло-серого или голубоватого цвета в S-форме.

- Читать далее "Среды для выделения, культивирования, идентификации микоплазм"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 5.3.2020