Среды для выделения, культивирования, идентификации микоплазм

а) Основа питательной среды для микоплазм на триптическом переваре сердечной мышцы быка (НИИ ЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН). Состав:
Триптический гидролизат мышцы говяжьего сердца — 200,0 мл
Мясная вода — 400,0 мл
Дрожжевой экстракт, 25%-ный раствор — 10,0 мл
Хлорид натрия (NaCl) — 5,0 г
Вода водопроводная — 300,0 мл

Приготовление гидролизата сердечной мышцы. К 1 части измельченного миокарда добавляют 1,5 части воды, кипятят 10 мин. Полусваренную массу пропускают через мясорубку, устанавливают pH 7,8-8,0. Фарш миокарда отделяют и к 10,0 л отвара добавляют 6,0 кг фарша, 1,5 кг поджелудочной железы и 300,0 мл хлороформа. Ферментация длится 10 дней при температуре 46°С, после чего устанавливают pH 7,4-7,6. Гидролизат хранят под хлороформом. Приготовление питательной основы (бульона). Смешивают гидролизат, мясную воду, добавляют дрожжевой экстракт, устанавливают pH 7,6-7,8. Стерилизуют при 121°С 15 мин.

Для приготовления полужидкой основы (для культивирования в пробирках) к готовому бульону перед стерилизацией добавляют 0,3% агара, для приготовления полутвердого агара (для чашек Петри) в бульон перед стерилизацией добавляют 1,3% агара.

К готовому бульону (или расплавленному и охлажденному до 45°С полужидкому или полутвердому агару) добавляют 20% нормальной лошадиной сыворотки и рабочий раствор пенициллина из расчета 100 ЕД на 1,0 мл готовой среды.

Питательную основу сред для микоплазм, а также ее ингредиенты, можно приобрести на Предприятии по производству медицинских иммунобиологических препаратов «Медгамал» (НИИ ЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН).

б) Питательные среды для культивирования и идентификации микоплазм различных видов. К 100,0 мл готовой стерильной питательной основы (жидкой, полужидкой, полутвердой), помимо 20% нормальной лошадиной сыворотки и пенициллина (100 ЕД/мл), стерильно добавляют: 2,0 мл 40%-ного раствора аргинина (для идентификации миконлазм, ферментирующих аргинин) или 1,0 мл 40%-ного раствора глюкозы (для М.pneumoniae), или 0,2 мл 25%-ного раствора мочевины (для U. urealyticum), стерилизованных через бумажный фильтр (величина пор 0,22 мкм), и по 1,0 мл 1%-ного автоклавированного раствора индикатора — фенолового красного.

Засеянные и инкубированные среды через 24-72 ч могут изменить цвет: среда с аргинином — из красно-желтой — в красно-малиновую, что свидетельствует о росте микоплазм; среда с глюкозой — из красно-желтой — в желтую, что свидетельствует о росте М.pneumoniae либо M.fermentans; среда с мочевиной — из красно-желтой — в красно-малиновую — рост U.urealyticum.

в) Бульон PPLO Broth, сухой (Difco). Состав:
Сухой порошок — 21,0 г
Дистиллированная вода — 700,0 мл
pH 7,6-7,8
Стерилизуют при 121°С 15 мин.

После стерилизации добавляют 200,0 мл нормальной лошадиной сыворотки. При необходимости используют бульон для приготовления дифференциально-диагностических сред: добавляют субстрат (стерильные растворы аргинина или глюкозы, или мочевины) и индикатор фенолово-красный, в соответствии с рекомендациями рецепта сред для идентификации микоплазм различных видов.

г) Агар PPLO Agar, сухой (Difco). Состав:
Стандартный порошок — 34,0 г
Дистиллированная вода — 1000,0 мл
pH 7,6-7,8
Стерилизуют при 121°С 15 мин.

Перед употреблением к расплавленному и остуженному до 45°С агару добавляют 20% нормальной лошадиной сыворотки, а также дифференциально-диагностические добавки, как указано в рецепте сред для культивирования и идентификации микоплазм различных видов (см. выше).

д) Среда SP-4 (для труднокультивируемых микоплазм M.pneumoniae, M.genitalium). Состав основы:
Микоплазменный бульон (Difco) — 1,0 г
Бактопептон (Difco) —1,6 г
Бактотринтон (Difco) — 3,0 г
Деионизированная вода — 197,0 мл
pH 7,8
Стерилизуют при 121°С 15 мин.

После стерилизации к охлажденному бульону стерильно добавляют: 0,5%-ный раствор (автоклавированный) фенолового красного — 1,2 мл; пенициллин до конечной концентрации 100/ЕДмл; дрожжевую вытяжку Yeastolate (Difco), стерилизованную последовательным фильтрованием через фильтры с порами 0,42 мкм и 0,22 мкм — 4,0 мл; пищевую добавку, применяемую при выращивании клеточных культур CMRL-1066(10х) с глутамином, без гидрокарбоната натрия NaHCO;; (Difco) — 15,0 мл; 25%-ный раствор свежего дрожжевого экстракта — 10,5 мл; фетальную сыворотку крупного рогатого скота, прогретую при 56°С 1ч — 3,0 мл; 50%-ный раствор глюкозы (стерильный) — 3,0 мл.

Окончательное значение pH — 7,4.

- Читать далее "Среды для индукции бактериальной L-трансформации"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 5.3.2020

Остались вопросы или замечания?

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.