Среды и реагенты для микробиологической диагностики туляремии

Для культивирования туляремийных бактерий применяют различные варианты агаровых питательных сред на рыбных, мясных, дрожжевых основах с обязательным добавлением 1% цистина (цистеина), 1% глюкозы, дрожжевого экстракта (источника витамина В). Чувствительность указанных агаровых сред можно повысить добавлением дефибринированной кроличьей или лошадиной крови (5-10%).

а) Свернутая желточная среда МакКоя. Среду готовят из желтков куриных яиц, которые тщательно моют, протирают спиртом, обжигают на пламени горелки, разбивают, сливают желтки, отделяя их отбелка, в стерильный сосуд, смешивают с 0,9%-ным раствором натрия хлорида. Жидкую среду разливают в пробирки по 4-5,0 мл и помещают в аппарат для свертывания сыворотки при наклонном положении пробирок, чем достигают скашивания среды. Свертывание среды производят при 80°С в течение 1 ч. Среду сохраняют при 4-6°С, предохраняя от высыхания. Если среда приготовлена правильно, на дне пробирки скапливается конденсационная жидкость. Готовую среду можно использовать в течение 1 мес.

б) Среда Емельяновой. Состав:
Дистиллированная вода — 100,0 мл
Гидролизат свежей рыбы — 20,0 мл (НПО «Микроген»)
Гидролизат желатина — 10,0 мл
Аутолизат дрожжей — 2,5 мл
Натрия хлорид (NaCl) — 0,5 г
Цистин — 0,1 г
Глюкоза —1,0 г
Агар — 1,5-2,5 г
pH 7,2-7,4
Стерилизация при 115°С 30 мин.

После стерилизации в расплавленную и охлажденную до температуры 45°С среду добавляют 10,0 мл кроличьей дефибринированной крови и разливают по чашкам Петри. Среда характеризуется высокими ростовыми качествами и обеспечивает рост при посеве единичных клеток в течение 2-5 сут. инкубации при температуре 37°С. Колонии бактерий, формирующиеся на этой среде, беловато-голубоватого оттенка, круглые, блестящие, с ровными краями, гладкие.

в) Среда Анциферова. К 100,0 мл расплавленного и охлажденного до температуры 45°С питательного агара добавляют 5,0 мл суспензии куриного желтка, разведенного 0,9%-ным раствором натрия хлорида в соотношении 3:2, разливают по пробиркам или чашкам Петри.

г) Среда Френсиса. Состав:
Дистиллированная вода — 100,0 мл
Пептон — 1,0 г
Натрия хлорид (NaCl) — 0,5 г
Цистин — 0,1 г
Глюкоза — 1,0 г
Агар - 1,5-2,5 г
pH 7,2-7,4

Стерилизация при 121°С 15 мин.

После стерилизации в расплавленную охлажденную до температуры 45°С среду добавляют 5-10,0 мл кроличьей дефибринированной крови и разливают по чашкам Петри.

д) Среда Т (туляремийная). Состав:
Дистиллированная вода — 100,0 мл
Сердечно-мозговой настой — 1,0 г
Бактотриптон — 1,0 г
Дрожжевой экстракт — 1,0 г
Казаминокислоты — 1,0 г
Бактоагар — 1,5 г
pH 7,2±0,1
Все компоненты фирмы «Difco».

Среду автоклавируют при температуре 121°С в течение 40 мин и хранят как питательную основу. В расплавленную среду добавляют раствор, содержащий в 5,0 мл дистиллированной воды, 0,005 г MgSO4 • 7Н2O; 0,001 г FeSO4 • 7Н2O; 0,06 г L-цистеина; 0,12 г лимоннокислого натрия; 0,2 г KCl, 0,4 г K2HPO4 • 3Н2O; 1,5 г глюкозы. Раствор перед добавлением в среду стерилизуют на водяной бане при температуре 100°С 40 мин. Для создания туляремийному микробу селективных преимуществ вереду вводят полимиксин В (100 мкг/мл). Среда обеспечивает рост единичных бактерий, которые формируют голубовато-беловатые прозрачные гладкие блестящие колонии.

е) АДТ-arap дрожжевой туляремийный. Выпускается Ростовским-на-Дону НИПЧИ.

ж) СКТ-селезеночно-казеиновый туляремийный агар. Выпускается Ростовским-на-Дону НИПЧИ.

з) FT-Francisella tularensis агар. Питательная среда для культивирования туляремийного микроба. Выпускается в виде комплекта, состоящего из рыбно-солевого агара (РСА), глюкозо-витаминной добавки (СД). Состав и способ приготовления среды полностью описаны в инструкции по применению FT-arapa, прилагаемой к комплекту. Производится ФГУН ГНЦ Прикладной микробиологии, г. Оболенск.

и) Среда для определения ферментативной активности туляремийного микроба. Состав:
Пептон — 1,0 г
Натрия хлорид (NaCl) — 5,0 г
Калия фосфат однозамещенный (KH2PO4) — 0,3 г
Цистеин — 0,1 г
Феноловый красный — 0,02 г
Субстрат (углевод, сахар, спирт) — 10,0 г
Дистиллированная вода — 1000,0 мл

В 1000,0 мл дистиллированной воды вносят ингредиенты, подогревают до полного растворения, остужают, устанавливают pH 7,2, разливают во флаконы по 100,0 мл. Стерилизуют автоклавированием при 115°С в течение 20 мин и стерильно разливают по 2,0 мл в стерильные пробирки (цвет среды оранжево-красный).

Культуру туляремийного микроба засевают в жидкую среду и инкубируют при 37°С до 5-6 сут. В случае ферментации углевода цвет среды становится желтым. При отрицательной реакции цвет среды остается без изменений.

к) Диагностикум для реакции микроагглютинации. Диагностикум для реакции микроагглютинации готовят из убитой культуры вакцинного штамма туляремийного микроба, которую окрашивают гематоксилином. Для этого взвесь культуры (смыв с агаровой среды) в концентрации 1011 м.к./мл смешивают в равных объемах с 1%-ным раствором формалина. После 2-часовой экспозиции клетки дважды отмывают от формалина 0,9%-ным раствором хлорида натрия. Осадок разводят до концентрации 5•109 м.к./мл и смешивают с равным объемом гематоксилина, приготовленного по методу Караччи (0,1 г гематоксилина растворяют в 100,0 мл дистиллированной воды, добавляют 25,0 мл глицерина, 5,0 г калийных квасцов и 2-3 кристалла йодноватистого калия. Раствор имеет вишневую окраску).

Окрашивание производят в водяной бане в течение 20-24 ч при 56°С при периодическом встряхивании культуры. Затем бактерии 3-4 раза отмывают физиологическим раствором, центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин до получения бесцветной прозрачной надосадочной жидкости. Осадок окрашенных бактерий разводят 0,9%-ным раствором хлорида натрия до оптимальной концентрации (обычно 2-5•109 м.к./мл). Для определения оптимальной концентрации диагностикума несколько его разведений испытывают в реакции микроагглютинации с диагностической туляремийной сывороткой. Диагностикум сохраняют при температуре 4°С, предварительно добавив в него формалин до конечной концентрации 0,1 %. Срок сохранения активности диагностикума не менее 6 мес.

- Читать далее "Среды для лабораторной диагностики сапа"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 5.3.2020

Остались вопросы или замечания?

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.