Staphylococcus aureus продуцирует целый ряд экзопротеинов, которые способствуют колонизации и развитию заболевания. Почти все штаммы производят группу гемолизинов и цитотоксинов. Главная функция этих белков — превратить локальные ткани в питательные вещества, необходимые для бактериального роста. Стафилококки продуцируют энтеротоксины, которые являются факторами патогенности и играют важную роль во всех заболеваниях, вызываемых стафилококками, от фурункула до сепсиса. Первичная функция энтеротоксинов in vivo, возможно, заключается в подавлении иммунного ответа к стафилококкам.

Основными продуцентами стафилококковых энтеротоксинов (СЭ) являются штаммы S. aureus, однако в настоящее время показано, что способностью образовывать энтеротоксины обладают также штаммы S. epidermidis, S. haemolyticus, S. xylosu, S. caprae, S. intermedius и S. hyicus, встречающиеся у животных и изредка у людей.

Установлено, что приблизительно 40-50% штаммов стафилококков, выделенных от здоровых людей, продуцируют СЭ.

S. aureus образует 21 термостабильных иммунологически различных типов СЭ (SEA, SEB, SEC, SED, SEE, SEI I, SEG, SEI, SEJ, SEK, SEE, SEM, SEN, SEO, SEP, SEQ, SER, SES, SET, SEU, SEV). СЭ являются внеклеточными белками стафилококков и синтезируются в виде одной полипептидной цепи. Несмотря на то, что этот класс токсинов назван энтеротоксинами, в строгом смысле слова они ими не являются, так как не вызывают накопления жидкости в лигированной петле кишечника кролика или диарейного синдрома в экспериментах на лабораторных животных. В большей мере эти токсины вызывают рвоту.

Кроме того, они стимулируют митогенную активность и продукцию лимфокинов в Т-лимфоцитах, усиливают летальную активность эндотоксинов липополисахаридов грамотрицательных бактерий, а также вызывают повышение температуры и гипотензию. Эти последние свойства характерны для пирогенных токсинов стрептококков, с которыми СЭ имеют целый ряд общих свойств.

а) Генетическое детерминирование продукции стафилококковых энтеротоксинов. Гены СЭ находятся на плазмидах, бактериофагах и островках патогенности. Ген для SEA, SEE, SEG, SEI, SEH локализован в хромосоме бактериальной клетки, однако генетическое картирование указывает на различную локализацию гена на хромосоме. SEB, SEC, SED, SEG, SEM, SEO заключены в плазмиде, а гены SEK, SEL находятся в островках патогенности. В связи с тем, что гены СЭ содержатся в плазмидах, бактериофагах, они могут передаваться от одного штамма другому. Синтез энтерогоксина регулируется геномом, который является ответственным за синтез регуляторного белка. Экспрессия генов энтерогоксинообразования контролируется регуляторными системами (agr А и В, sar и катаболитной супрессией).

Каждый токсин продуцируется в виде белка-предшественника, содержащего аминотерминальную последовательность сигнала, которая отщепляется во время выхода из клетки. Известно, что agr контролирует транскрипты РНК II и РНК III, которые участвуют в регуляции генов в поздней логарифмической фазе роста. Показано, что agr А имеет гомологию с сигнальными бактериальными протеазами, a agrB — с про-теинкиназами. В одних случаях эти гены действуют как супрессоры, а в некоторых случаях — как позитивные регуляторы, однако каким образом они осуществляют регуляцию, не известно.

б) Факторы, влияющие на продукцию стафилококковых энтеротоксинов и условия культивирования продуцентов. Стафилококки могут расти как на селективной среде, содержащей аминокислоты и ростовые факторы, так и на сложной белковой среде, однако замечено, что продукция СЭ на селективной среде значительно снижена. Не выявлено значительной разницы в питательных потребностях между токсигенными и неэнтеротоксигенными штаммами S. aureus.

Выбор среды для получения СЭ зависит во многом от того, для какой цели готовят энтеротоксин — для очистки или для его выявления.

При получении энтеротоксинов для последующей их очистки важным фактором является использование питательной среды, простой по составу, содержащей как можно меньше белков, способной легко диализоваться и обеспечивать высокий выход энтеротоксина.

Если же целью является выявление наличия энтеротоксинов у штаммов стафилококка, то рекомендуется использовать среды с высоким содержанием белков и пептидов.

Продукция СЭ происходит в более ограниченном диапазоне физико-химических факторов, чем рост стафилококков. Количество продуцируемого СЭ зависит от многих факторов, таких как вид пищевого продукта, pH, температура, водная активность, атмосферные условия и присутствие других микроорганизмов.

Следует отметить, что SEA и SEB продуцируются на различных стадиях роста стафилококков. Синтез SEA большей частью приходится на раннюю log-фазу роста. SEA ведет себя как основной метаболит (хотя приблизительно 20% токсина продуцируется во время начальной стационарной фазы), в то время как синтез SEB на 95% происходит в поздней log-фазе и ранней стационарной фазе роста. Отсутствие SEB до конца логарифмической фазы роста, его накопление в течение стационарной фазы и после изменения pH среды означает, что он является вторичным метаболитом. Хлорамфеникол и 2,4-динитрофенол препятствуют образованию SEA, но некоторые количества токсина вырабатываются неразмножающимися клетками в присутствии стрептомицина и пенициллина G. Показано, что рост стафилококков не обязательно коррелирует с продукцией СЭ.

Минимальная величина активности воды (aw) для продукции СЭ в искусственной среде несколько выше, чем минимум для роста стафилококков. Для SEB aw составляет 0,97, а для SEA — ниже 0,90. Водная активность, при которой идет синтез СЭ, находится в диапазоне от 0,83-0,991. Оптимум активности воды для продукции СЭ более 0,99. Стафилококки способны продуцировать СЭ при концентрации хлористого натрия до 10,0% (активность воды — 0,92). Концентрация хлористого натрия 12 % уже ингибирует синтез СЭ независимо от pH среды.

Продукция стафилококковых энтеротоксинов происходит в широком диапазоне pH (4,0-9,83). Оптимальным для продукции энтеротоксинов является pH 6,5-7,3. Однако при pH 5,0 штаммы стафилококков, продуцирующие SEB, образуют мало энтеротоксина при хорошем росте клеток, в то время как продукция SEA происходит в одинаковом количестве независимо от pH.

Размножение стафилококков в пищевых продуктах и образование энтеротоксина зависит также от температуры. Диапазон температуры, при которой идет продуцирование СЭ, — от 10 до 38НС, оптимум — при 35-38°С. Чем ниже температура, тем медленнее идет накопление возбудителя и энтеротоксина, при температуре 5-7°С этот процесс прекращается. При комнатной температуре в обсемененной стафилококками пище количество энтеротоксина, способное вызвать пищевое отравление, может накопиться, например, в котлетах в течение 3 ч, а в заварном креме — за 4 ч.

S. aureus считается требовательным микроорганизмом в отношении питательных веществ. Так, при исследовании энтеротоксинообразования у пяти штаммов S. aureus, которые продуцируют SEA, SEB или SEC, было установлено, что валин необходим для роста стафилококков, а аргинин и цистин — и для роста бактерий, и для продукции СЭ. Потребности в других аминокислотах при синтезе СЭ варьируют в зависимости от штамма. Глюкоза по-разному влияет на биосинтез различных типов СЭ. Так, 5% концентрация глюкозы в среде не влияет на продукцию SEA, но ингибирует продукцию SEB и SEC. Уксусная и молочная кислоты ингибируют продукцию СЭ. Ингибирующим действием на продукцию СЭ обладают молочнокислые бактерии — лактобациллы и микрококки, а также конкурирующая микрофлора.

Бактерицидное влияние молочно-кислой закваски происходит главным образом вследствие образования молочной кислоты и понижения pH, продукции перекисного кислорода, конкуренции за питательные вещества и иногда вследствие синтеза антимикробного вещества — низина, продуцируемого молочно-кислыми бактериями. Продукция SEB ингибируется твином-80, олеиновой кислотой, дезоксихолатом натрия, пенициллином, Д-циклосерином и бацитрацином, однако эти вещества не влияют значительно на рост.

Панкреатический гидролизат казеина повышает выработку СЭ по сравнению с кислотным гидролизатом казеина. Питательными основами являются кислотные и ферментативные гидролизаты белка, сердечно-мозговой настой, иногда с добавлением экстракта дрожжей. В качестве добавок используют аминокислоты, тиамин, никотиновую кислоту, соли. Примером такой среды является среда Е.Р. Касман, модифицированная Ф.С. Флуер и др.

Показано, что аэрированные культуры образуют в большем количестве СЭ и быстрее, чем статические культуры.

Происхождение штаммов стафилококков также влияет на токсигенность. Установлено, что штаммы S. aureus, выделенные от людей, чаще продуцируют SEA, в то время как штаммы стафилококков, выделенные от коров, продуцируют SEC или SED, от овец — SEC.

Количество образуемого СЭ зависит также от штаммов, которые могут резко отличаться друг от друга, и от типа энтеротоксина. Выход большинства энтеротоксинов может быть повышен селекцией колоний. Наибольшее количество энтеротоксина продуцируют штаммы стафилококков, образующие SEB. Так, клонированные селекционные штаммы могут продуцировать до 500 мкг/мл SEB, 60 мкг/мл типа SEC и до 10 мкг/мл SEA.

в) Физико-химические свойства. Стафилококковые энтеротоксины являются простыми полипептидными цепями, состоящими из 239-296 остатков аминокислот, их молекулярная масса — от 24 000-29 000 дальтон. СЭ имеют изоэлектрические точки в пределах 5,7-8,66.

Внутри полипептидная цепь СЭ связана дисульфидным мостиком, образующим так называемую дисульфидную петлю, которая играет важную роль в проявлении рвотного действия СЭ. Однако молекулы некоторых СЭ, таких как SEI, SEK, не имеют дисульфидной петли, и поэтому обладают более слабым рвотным действием.

г) Стабильность стафилококковых энтеротоксинов. Одним из наиболее важных свойств СЭ является их термоустойчивость. Они более устойчивы к повышенной температуре, чем другие бактериальные токсины и бактериальные клетки. Большинство СЭ выдерживают нагревание до 100°С. Инактивированные СЭ под действием температуры могут быть реактивированы. Наилучшие результаты реактивации получены после деактивации при 80°С, причем реактивация токсина происходит быстрее при 25°С, чем при 4°С. Более быстрая потеря активности токсина при 80 °С, чем при 100 °С, объясняется образованием агрегатов молекул токсина.

Резистентность к теплу у СЭ зависит от продолжительности экспозиции, от типа и концентрации энтеротоксина, от растворителя, в котором нагреваются энтеротоксины. Стафилококковые энтеротоксины более стабильны в неочищенном виде, чем в очищенном. SEB и SEC более термостабильны, чем SEA.

Имеются лишь отрывочные сведения о стабильности энтеротоксинов при хранении в различных средах. Так, SEB при хранении в 0,05 М фосфатном буфере при pH 4,0-7,3 сохраняет свою активность в течение недели. Энтеротоксин SEE при хранении в фосфатном буфере при pH 7,0 и температуре 2-5°С сохраняет серологическую активность в течение 6 мес. В сыре энтеротоксины сохраняют свою активность в течение 3 лет.

Способность энтеротоксинов вступать в реакции с гомологичными антисыворотками утрачивается при pH 1,85 и 12,0.

Стафилококковые энтеротоксины проявляют устойчивость к гидролизу такими ферментами, как трипсин, химотрипсин, ренин и папаин. Пепсин способен разрушать энтеротоксины при pH 2,0, но не при более высоких значениях.

д) Иммунологические свойства. Все известные типы СЭ обладают индивидуальной антигенной специфичностью, на чем основано отнесение их к 21 серотипу. Перекрестные реакции наблюдаются между SEA и SEE и гремя подтипами SEC₁, SEC₂, SEO₃.

Для приготовления антисыворотки, высокоспецифичной для энтеротоксинов, используют кроликов. Все СЭ являются сравнительно слабыми антигенами, что осложняет приготовление и производство антител к ним. При получении антиэнтеро-токсических сывороток приходится учитывать слабые антигенные свойства СЭ и использовать напряженные схемы иммунизации, так как только такой подход позволяет получать антиэнтеротоксические сыворотки с более высоким титром антител. Антисыворотки могут быть применены для обнаружения энтеротоксинов in vitro в различных иммунологических реакциях. Коммерческие стафилококковые антиэнтеротоксические сыворотки производятся в НИИЭМ им. Л. Пастера (Санкт-Петербург), а также фирмой «Serva» (Германия).

Специфические антитела к SEA, SEB, SEC были обнаружены в сыворотках как здоровых людей, так и лиц, перенесших пищевое отравление стафилококковой этиологии, но значения циркулирующих в сыворотке крови антител к энтеротоксинам пока неизвестно. В исследованиях, проведенных в США, было обнаружено, что у 70% населения в сыворотке содержатся гемагглютинирующие антитела, а у 30% — преципитирующие. Эти показатели несколько отличаются от таковых у жителей Южной Азии: во всех пробах сывороток содержались гемагглютинирующие антитела и в 90% — преципитирующие антитела. Однако повышенный титр антител к СЭ не может предотвратить пищевого отравления. В опытах на обезьянах показано, что у животных с более высоким титром антител к СЭ пищевые отравления протекали всего лишь в более легкой форме. При этом антитела к одному типу СЭ не всегда могут проявлять защитные свойства против СЭ других типов.

- Читать далее "Механизм действия стафилококковых энтеротоксинов"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 11.11.2019