а) Тесты на сахаролитическую активность. Тесты на сахаролитическую активность применяются в комплексе реакций для дифференциальной диагностики и идентификации большинства патогенных бактерий, при условии, что для каждого вида возбудителя подбирается набор углеводов, соответствующий его метаболическим свойствам. Тесты основаны на способности исследуемого микроорганизма утилизировать углевод, введенный в питательную среду, с образованием кислых продуктов и газа, выявляемых по изменению цвета индикатора и образованию пузырьков.

Рецепты питательных сред для постановки тестов, техника постановки и учет результатов.

б) Окисление-брожение. В бактериологических культурах процесс расщепления органических субстратов может идти двумя путями. В аэробных условиях этот процесс идет с участием свободного кислорода (реакции окисления, завершающиеся расщеплением углеводов до конечных продуктов распада — воды и углекислого газа). В анаэробных условиях необходимую для жизнедеятельности микроорганизмов энергию обеспечивают реакции брожения (ферментативного анаэробного процесса, происходящего даже в присутствии кислорода воздуха).

Например, при ферментативном процессе утилизации глюкозы происходит фосфорилирование-дефосфорилирование с постепенной ее деградацией до углекислого газа и молочной кислоты. В зависимости от конечных продуктов реакции различают молочнокислое, спиртовое, уксуснокислое брожение и др.

в) Тест окисления-брожения (тест на оксидацию-ферментацию, или OF). При изучении утилизации микроорганизмами углеводов необходимо:
— во-первых, определить, какие углеводы и их производные используются микроорганизмами в качестве субстрата реакции;
— во-вторых, установить, каким путем (окисления или ферментации) углевод утилизируется.

Тест основан на том, что при окислительном процессе (независимо от субстрата окисления) молекулы кислорода являются конечным акцептором водорода (протонов) и электронов. Ферментация (брожение) углеводов происходит как в анаэробных, так и в аэробных условиях с участием специфических сахаролитических ферментов. При этом донорами и акцепторами электронов являются органические соединения (чаще гексозы).

Техника постановки теста. Для постановки теста используют специальные окислительно-восстановительные (OF) питательные среды с низкой концентрацией пептона и единственным углеводным субстратом (в приведенном конкретном примере — глюкоза).

В 2 пробирки помещают 3-4 мл стерильной среды Хью-Лейфсона. Каждую из них инокулируют (уколом) небольшим количеством чистой культуры исследуемых бактерий. В одну из этих пробирок для создания анаэробных условий непосредственно после посева наливают, соблюдая правила асептики, стерильное минеральное масло, создавая слой толщиной не менее 5 мм.

Засеянные пробирки инкубируют в термостате при температуре 36(±1)°С с ежедневным, в течение 3-4 сут., просмотром микробного роста.

Учет результатов осуществляется по изменению цвета питательной среды соответственно цвету введенного в нее индикатора при pH 6,0-6,5 по следующей схеме:

г) Тест на β-галактозидазу (тест с о-нитрофенил-β-D-галактониранозидом, ONPG). Энзиматический гидролиз лактозы — один из дифференциально-диагностических признаков при изучении возбудителей бактериальных инфекций. Последние делятся на 2 основные группы: ферментирующие и не ферментирующие лактозу, или, соответственно, лактозопозитивные и лактозонегативные.

Однако при обследовании больных и носителей бактериологи нередко сталкиваются с лактозоотрицательными или замедленно ферментирующими лактозу штаммами, которые по результатам совокупности проведенных дифференциально-диагностических тестов соответствуют лактозоположительным видам бактерий. При окончательной идентификации культур возникает вопрос об их способности продуцировать β-галактозидазу, поэтому необходимо прибегать к постановке теста с реактивом ONFG.

Тест основан на том, что фермент β-галактозидаза (лактаза) катализирует расщепление дисахарида лактозы на два моносахарида — глюкозу и галактозу. В ферментативном гидролизе лактозы принимают участие два фермента: β-галактозидаза и ферментоподобный транспортный белок — лактозопермеаза. В бактериальных культурах, не синтезирующих лактозопермеазы или образующих ее в крайне малых количествах, лактоза не сбраживается, или процесс сбраживания происходит крайне медленно. Причины задержки сбраживания лактозы (отсутствие лактозопермеазы или дефицит в ее образовании) определяют в реакции с реактивом ONPG.

ONPG — о-нитрофенил-β-D-галактопиранозид представляет собой нитрофенил-замещенную галактозу, стуктурно схожую с лактозой и катализируемую тем же ферментом β-галактозидазой), который гидролизует лактозу. Из бесцветного реактива ONPG образуются два конечных продукта о-нитрофенил и галактоза. При гидролизе высвободившийся из соединения о-нитрофенил приобретает присущий ему желтый цвет, придающий соответствующую окраску содержимому пробирки. Таким образом, он является индикатором присутствия в исследуемой культуре фермента β-галактозидазы.

Техника постановки теста. Отобранные для исследования колонии снимают бактериальной петлей с любой плотной питательной среды, содержащей лактозу. Культуру эмульгируют в 0,25 мл изотонического раствора натрия хлорида. Приготовленная взвесь — густая, молочного цвета.

В хорошо смешанную гомогенную взвесь добавляют 1 каплю толуола для экстракции фермента из бактериальных клеток. Пробирки после тщательного встряхивания помещают в термостат или на водяную баню на 30-40 мин. После инкубации в термостате к взвеси бактерий добавляют 0,25 мл свежеприготовленного бесцветного реактива ONPG. Приготовленную смесь вновь помещают в термостат.

Учет результатов производится через 2-3 и 24 ч инкубации пробирок. При положительном результате (синтез фермента β-галактозидазы) содержимое пробирок окрашивается о-нитрофенолом в желтый цвет. При отрицательной реакции бесцветный комплекс ONPG не расщепляется и не вызывает изменений цвета микробной взвеси.

Положительный контроль: Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Klebsiella oxytoca.

Отрицательный контроль: Proteus mirabilis.

- Читать далее "Тест на образование сероводорода (H2S) для идентификации бактерий"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 21.2.2020