Вся исследовательская работа зависит от того, насколько надежны методы измерения. У вирусов нас прежде всего интересует определение инфекционности. Количество инфекционного вируса в данной суспензии можно «оттитровать», заражая культуру клеток, куриные эмбрионы или лабораторных животных вирусной суспензией в различных разведениях, и затем в течение нескольких дней наблюдать за появлением признаков, свидетельствующих о размножении вируса. Различают два типа определения инфекционности: количественное и квантальное.

Хорошо известным примером определения такого типа может служить подсчет колоний, образованных бактериями на чашке с агаром. Каждый жизнеспособный микроорганизм, размножаясь, образует дискретный клон; следовательно, подсчитывая колонии, мы непосредственно определяем исходное число бактерий. Подобные же методы в вирусологии основаны на подсчете локальных повреждений (оспин) на хорионе куриного эмбриона или стерильных пятен (бляшек) на монослое культуры клеток.

Метод бляшек. Дульбекко (1952), а также Дульбекко и Фогт (1954) модифицировали метод количественного определения бактериофагов по числу стерильных пятен и применили его для вирусов животных. В настоящее время этот метод количественного определения вирусов животных наиболее широко распространен. Суспензию, содержащую вирус, помещают на клеточный монослой и оставляют примерно на час, с тем чтобы вирионы прикрепились к клеткам; затем жидкость замещают плотным гелем, который ограничивает распространение дочерних вирусных частиц, так что ими могут быть заражены только клетки, соседние с первоначально инфицированными. Таким образом, каждая инфекционная частица дает локальное скопление зараженных клеток, которое через несколько дней становится настолько большим, что его можно видеть невооруженным глазом.

Для получения геля, которым покрывают клетки, используют весьма разнообразные вещества, в том числе агар, метилцеллюлозу, трагакант, крахмал. Наиболее часто употребляют агар, однако недостатком агарового геля является присутствие в нем сульфополисахаридов, подавляющих рост некоторых вирусов. Подавляющее действие полисахаридов можно нейтрализовать, добавив в гель ДЕАЕ-декстран. Обязательным компонентом геля должна быть питательная среда, необходимая для поддержания клеток в жизнеспособном состоянии.

После инкубационного периода продолжительностью от 2 дней до 4 нед в зависимости от изучаемого вируса клеточный монослой окрашивают каким-либо прижизненным красителем, например нейтральным красным или тетразолием. Живые клетки адсорбируют краситель, и бляшки выглядят как светлые пятна на красном фоне. Вирусы, которые не обладают свойством разрушать клетки, можно оттитровать сходным образом, выявляя бляшки с помощью гемадсорбции, интерференции или флуоресцирующих антител. Некоторые вирусы, например герпесвирусы и поксвирусы, способны образовывать бляшки в монослое даже без плотного покрытия. Это объясняется тем, что большая часть вновь образованных вирусных частиц остается связанной с клетками и бляшки образуются путем распространения вируса из клетки в клетку через межклеточные мостики.

Разработанный Дульбекко метод бляшек имеет ряд модификаций (Купер, 1967). Например, можно адсорбировать вирус на клетках, находящихся в виде суспензии, а затем дать этим клеткам прикрепиться к стеклу и покрыть их агаром или зараженную вирусом суспензию клеток поместить непосредственно в агар. Последний метод пригоден только для мелких вирусов, размеры которых позволяют им диффундировать через агар от клетки к клетке. Образующиеся при этом бляшки имеют сферическую форму.

Обычно для образования бляшки достаточно одной вирусной частицы (Дульбекко и Фогт, 1954); поэтому инфекционный титр исходной вирусной суспензии может быть выражен как число бляшкообразующих единиц (БОЕ), содержащихся в 1 мл. Ошибка будет минимальной, если определять титр па чашкам, зараженным разведениями вируса, дающими от 20 до 100 бляшек (в зависимости от их размера). Этого числа бляшек достаточно для того, чтобы свести к минимуму ошибку, вычисленную по Пуассону (распределение небольшого числа дискретных частиц), и вместе с тем оно позволяет избежать перекрывания соседних бляшек.

- Читать далее "Оценка инфекционности вирусов. Методы определения инфекционности"