а) Способы взятия и посева исследуемого материала. Немаловажную роль при осуществлении исследования на наличие Р. aeruginosa играет способ взятия исследуемого материала. Здесь необходимо соблюдать следующие рекомендации:

1) брать исследуемый материал желательно либо до начала лечения больного антибактериальными препаратами, либо после того, как применяемый препарат уже выведен из организма;

2) клинический материал для анализа должен быть взят непосредственно из воспалительного очага инфекции с соблюдением всех необходимых правил асептики (стерильными инструментами, тампонами, в стерильную посуду и т.д.);

3) в случаях, когда взятие материала непосредственно из инфицированного очага осуществить невозможно, но он сообщается с внешней средой, производят исследование соответствующего отделяемого (например, мочи при пиелонефрите, мокроты при пневмонии, отделяемого цервикального канала или влагалища при воспалении высших отделов гениталий и др.).

б) Схема и методы исследования материала:

Первый день. Гной, отделяемое ран, мокроту, слизь, мочу и др. засевают непосредственно на простые, элективные и селективные среды: мясопептонный агар (МПА), 5%-ный кровяной агар, агар Эндо, агар с цетилпиридиния хлоридом (ЦПХ-агар); посевы инкубируют 16-18 часов при температуре 37°С.

Смывы с поверхности предметов, рук персонала, аппаратуры, инвентаря и др. засевают для накопления в мясопептонный бульон (МПБ) или бульон Хоттингера. Культивируют при температуре 37°С в течение 18-24 ч. Затем содержимое пробирки в количестве 0,2 мл высевают на чашки с вышеуказанными плотными средами, тщательно втирая материал шпателем. Посевы инкубируют 16-18 часов при температуре 42°С.

Второй день. Отмечают наличие или отсутствие роста культур синегнойной палочки на жидких и плотных питательных средах. При выращивании культур синегнойной палочки в бульоне в течение 18-24 часов образуется гомогенная взвесь с серебристой сероватой пленкой на поверхности среды.

Засеянные накануне исследуемым материалом агаровые чашки просматривают и отмечают колонии, подлежащие дальнейшему изучению. На обычных питательных средах различают 5 морфологических типов колоний синегнойной палочки:
• плоские колонии неправильной формы;
• колонии, напоминающие S-колонии кишечной палочки;
• колонии со складчатой поверхностью («цветок маргаритки»);
• мукоидные колонии, которые редко дают пигментацию при первичном выделении, а образующийся слизистый налет со временем приобретает зеленую окраску
• карликовые колонии, формирующиеся при инкубировании посевного материала при температуре 37°С не менее чем в течение 18 ч.

Рост Р. aeruginosa на агаризованной среде часто сопровождается феноменом «радужного» лизиса, который характеризуется наличием нежного блестящего металлического налета и зон просветления агара. В 80-90% случаев вокруг выросших на кровяном агаре колоний синегнойной палочки выявляется четкая зона гемолиза. На среде Эндо культуры синегнойной палочки образуют бледно-розовые колонии небольших размеров (лактозонегатпвные колонии).

Встречающиеся так называемые мукоидные штаммы продуцируют повышенное количество слизи в любых условиях. Чаще всего такие штаммы выделяются из мокроты больных муковисцидозом, но иногда они присутствуют и при других поражениях бронхолегочной системы, например при бронхоэктатической болезни.

Примерно 75% выделенных культур Р. aeruginosa можно идентифицировать на 2-й день по морфологии колоний, наличию роста на селективных средах и образованию сине-зеленого пигмента, являющегося уникальным признаком культур синегнойной палочки. Беспигментные подозрительные колонии пересевают на среду Кинга А.

Беспигментные колонии (с каждой чашки не менее трех колоний, одинаковых по виду) собирают и суспендируют в 0,5 мл изотонического раствора натрия хлорида, а затем отсевают на среду Кинга А или Хью-Лейфсона для OF-теста; на среды Гисса с глюкозой с последующей инкубацией в аэробных и анаэробных условиях; на среды с желатином, с аргинином на нитратный бульон и на любую обычно принятую питательную среду с целью выявления способности роста при 5 и 42°С для дифференциации культур Р. aeruginosa и P.fluorescens. Подозрительные колонии подвергают тесту на оксидазу.

Третий день. Учитывают результаты ряда биохимических тестов. Дифференциальные биохимические характеристики, присущие штаммам синегнойной палочки, другим представителям Pseudomonas, содержатся в таблице ниже. Культуры синегнойной палочки характеризуются наличием цитохромоксидазной активности (положительный оксидазный тест) и обладают слабой сахаролитической активностью, расщепляя только глюкозу с образованием кислоты без газа в аэробных условиях. Протеолитически активны (разжижают желатин), образуют аммиак из аргинина в аэробных условиях, восстанавливают нитраты в нитриты, а последние редуцируют до газообразного азота. Окончательный учет результатов некоторых биохимических тестов осуществляется в более поздние сроки (спустя 48 или 72 часа).

Основными дифференциальными признаками штаммов Р. aeruginosa и P.fluorescens являются термофильность бактерий вида Р. aeruginosa (наличие роста при 42°С и отсутствие роста при 5°С) и их способность утилизировать ацетамид при посеве на ацетамидный агар, который подщелачивается при положительном тесте.

По окончании исследования полученные данные необходимо сравнить с признаками, характерными для Р. aeruginosa, которые приведены выше, в таблице ниже.

Следует отметить, что для определения Р. aeruginosa можно также использовать наборы, предназначающиеся для идентификации энтеробактерий. Достаточно хорошие результаты получены при использовании систем API-20E (Франция).

Среди представленных в таблице ниже тестов цитохромоксидаза — первый, с которого следует начинать идентификацию подозреваемых на принадлежность к Р. aeruginosa (положительный результат проявляется уже через 30 секунд. Далее следует выявление таких свойств, как термофильность (рост при 42°С и его отсутствие при 5°С), способность окислять глюкозу на среде Хыо-Лейфсона в аэробных условиях и возможность расти на ацетатамидном агаре (см. раздел 5.8.). Р. aeruginosa лизирует эритроциты, восстанавливает нитраты до нитритов. Кроме того, посев тест-культур на среды Кинга А и В позволяет дополнительно идентифицировать 5-10% штаммов по образованию характерных пигментов.

Для этого микроорганизма характерны положительные тесты — на образование аргининдигидролазы, каталазы, отрицательные — на образование сероводорода, лизин- и орнитиндекарбоксилазы. Р. aeruginosa не образует индол, не дает реакции с метиловым красным и ацетилметилкарбинолом (реакция Фогеса-Проскауэра).

Таким образом, наиболее информативными, надежными и доступными для лабораторий тестами идентификации синегнойной палочки являются:
• рост на среде с ЦПХ;
• положительный цитохромоксидазный тест;
• выявление термофильности (рост при температуре 42°С и его отсутствие при температуре ниже 5°С);
• способность окислять глюкозу на среде Хью-Лейфсона в аэробных условиях и расти на ацетамидном агаре.
• кроме того, ранний посев исследуемых тест-культур на среды Кинга А и В позволяет дополнительно идентифицировать 5-10% штаммов по способности образовывать характерные пигменты.

С помощью такой схемы установить синегнойную этиологию можно в течение 24-48 ч. Другие дифференциально-диагностические признаки также являются достаточно доступными и информативными при дифференциации синегнойной палочки и других представителей рода Pseudomonas.

- Читать далее "Определение чувствительности синегнойной палочки к антибактериальным препаратам (методы определения и критерии оценки)"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 8.4.2020