Лабораторная диагностика возбудителей криптоспоридиоза (Cryptosporidium)

а) Виды клинического материала, подлежащего лабораторному исследованию, взятие материала, доставка, хранение, обработка. О криптоспоридиозе следует думать при появлении водянистой диареи у больного, особенно у детей и лиц с нарушениями иммунного статуса.

Подлежащие обследованию контингенты:
1. Больные с длительно сохраняющимся диарейным синдромом.
2. Пациенты инфекционных кишечных стационаров.
3. Больные ВИЧ-инфекцией с признаками кишечной дисфункции.
4. Лица, контактировавшие с больными криптоспоридиозом и ранее переболевшие (реконвалесценты).

Исследуемые материалы:
1. Фекалии больных.
2. Рвотные массы.
3. Мокрота и лаважная жидкость (при подозрении на криптоспоридиоз органов дыхания).

Подтверждением диагноза может служить обнаружение ооцист криптоспоридии в исследуемом материале. До 1978 г. для установления диагноза требовалась биопсия тонкой кишки. По мере разработки эффективных методов обогащения и окраски, стало возможным выделение и идентификация ооцист криптоспоридий из фекалий больных. Выделение ооцист с фекалиями наиболее интенсивно происходит в течение первых 4 или 5 дней болезни, постепенно снижается на протяжении 2-й недели и, как правило, прекращается в течение 2 или 3 дней после окончания диареи. Ооцисты редко выделяются из оформленных фекалий.

Пробы необходимо исследовать сразу же после дефекации или помещать в консерванты: 10 %-ный буферный раствор формалина, 2,5 %-ный раствор калия дихромата или в консервант Турдыева или Сафаралиева. Свежие и помещенные в раствор пробы являются заразными, и с ними нужно обращаться с осторожностью.

Для диагностики кринтоспоридиоза достаточно факта обнаружения ооцист паразита в окрашенном мазке из исследуемых биоматериалов.

б) Методы выявления криптоспоридий в материале. Наиболее распространенные методики для выявления ооцист в фекалиях (копроцитологические исследования) включают модификации методов окрашивания кислотоустойчивых организмов (чаще карболовым фуксином по Цилю-Нельсену в модификации или азуром и эозином по Романовскому-Гимзе). Если приходится исследовать образцы, которые могут содержать немного ооцист, применяют методы обогащения (чаще флотация и седиментация, широко используемые в паразитологии).

1. Приготовление мазка фекалий. На предметное стекло поместить 1-2 капли изотонического (0,9 %) раствора хлорида натрия. На это же стекло поместить небольшой комочек свежих фекалий, смешать с изотоническим раствором до получения гомогенной массы, сделать тонкий мазок и тщательно высушить его на воздухе (не менее 30 мин). Крупные частицы удалить скальпелем, мазок зафиксировать смесью Никифорова 10-15 мин и тщательно высушить на воздухе.

2. Окрашивание карбол-фуксином по Цилю-Нельсену (модификация). Фиксированный мазок быстро провести 3-5 раз над пламенем горелки. Окрашивать раствором карбол-фуксина 30-40 мин. Промыть мазок водопроводной водой, обесцветить 7 % (5-10%) раствором серной кислоты 20-60 сек, промыть в воде и подкрасить 5 мин. 5%-ным раствором малахитового зеленого в 10%-ном этиловом спирте или 0,2 %-ным водным раствором метиленового синего. Промыть в воде, тщательно высушить на воздухе и исследовать под микроскопом (с иммерсией).

Ооцисты криптоспоридий окрашиваются в разные оттенки ярко-красного цвета и имеют вид округлых образований диаметром до 5 мкм. Внутри некоторых ооцист удается рассмотреть удлиненные спорозоиты. Сопутствующая микрофлора окрашивается в зеленые или синие тона.

Следует заметить, что в красный цвет могут окрашиваться капли жироподобных веществ и гранулы детрита. Даже при случайном сходстве по размерам эти образования легко отличить от ооцист криптоспоридий по отсутствию у них отчетливой оболочки и какого-либо структурированного содержимого внутри. В сомнительных случаях серийные мазки следует окрасить иным методом. Данный метод считается одним из наиболее демонстративных и надежных для выявления ооцист криптоспоридий. Краска не выцветает много месяцев.

3. Окрашивание сафранином по Кестеру. Мазок, высушенный на воздухе, фиксировать смесью Никифорова, снова высушить на воздухе при комнатной температуре и фиксировать над пламенем горелки. Окрашивать в растворе сафранина 5 мин. После споласкивания водой дифференцировать 10 сек в 0,1 %-ном растворе серной кислоты, промыть в воде и окрашивать 5 %-ным раствором малахитового зеленого 10-15 сек.. Промыть в воде, тщательно высушить на воздухе и исследовать под микроскопом (с иммерсией).

Ооцисты криптоспоридий окрашиваются в бледно-розовый цвет и хорошо выделяются на зеленом фоне. Другие микроорганизмы не окрашиваются сафранином.

Этот метод считается одним из наиболее точных при выявлении ооцист криптоспоридий, позволяя наиболее отчетливо видеть внутреннее содержимое ооцист (спорозоиты). Краска нестабильна, препараты быстро выцветают.

4. Окрашивание азур-эозином по Романовскому-Гимзе. Этот широко распространенный метод окрашивания мазков крови может быть успешно применен и при выявлении ооцист криптоспоридий. В ряде случаев он весьма информативен, поскольку при адекватной предварительной подготовке мазка краситель проникает внутрь ооцисты и окрашивает спорозоиты.

Мазок, фиксированный смесью Никифорова и тщательно высушенный на воздухе, быстро провести над пламенем горелки (3-5 быстрых движений). Окрасить 10 %-ным раствором красителя 30-45 мин. Затем тщательно промыть в воде (лучше в проточной водопроводной), высушить на воздухе (можно в струе холодного воздуха под феном) и исследовать под микроскопом с иммерсионной системой.

Ооцисты криптоспоридий имеют вид неокрашенных или слабо окрашенных округлых образований диаметром до 5 мкм. Внутри некоторых ооцист удается рассмотреть бледно-голубые удлиненные и слегка изогнутые тельца (спорозоиты) с красноватыми гранулами внутри. Спорозоиты располагаются по периферии ооцисты, оставляя ее центральную часть пустой.

Идентификация ооцист криптоспоридий затруднена в связи с тем, что другие микроорганизмы кишечника также окрашиваются азур-эозином, причем значительно интенсивнее ооцист. В связи с этим необходимо делать тонкие мазки, в которых наложение микрофлоры на ооцисты не «экранировало» бы последние от наблюдателя. Окрашенные препараты не выцветают в течение многих месяцев.

5. Метод формалин-эфирного обогащения. Помимо методов флотации и седиментации, широко используемых в паразитологии, в настоящее время все большее применение находит метод формалин-эфирного обогащения.

Собранные во флакон с консервантом Турдыева фекалии тщательно перемешивают и фильтруют через один слой марли в мерную центрифужную пробирку. К 4-4,5 мл фильтрата добавляют до 8 мл 10 %-ного формалина и 2 мл эфира. Пробирку закрывают пробкой (от пенициллинового флакона) и энергично встряхивают. После центрифугирования в течение 3 мин при 1500 об/мин палочкой осторожно отделяют от стенок пробирки образовавшуюся фекальную пробку и содержимое выливают, перевернув пробирку вверх дном. Излишки влаги со стенок пробирки удаляют ватным тампоном. Обогащенный осадок, оставшийся на дне пробирки, переносят на предметное стекло и круговыми движениями готовят мазок. После тщательного высушивания мазок фиксируют 20-30 мин в смеси Никифорова. Снова высушивают, окрашивают по модифицированному методу Циля-Нельсена и микроскопируют с масляной иммерсией.

в) Отождествление выделенного микроорганизма с возможным этиологическим фактором оппортунистической/внутрибольничной инфекции. При появлении жидкого водянистого стула со зловонным запахом, особенно у детей до 5 лет и у лиц с иммунодефицитами, следует подумать о возможности криптоспоридиоза.

Подтверждением диагноза может служить обнаружение ооцист криптоспоридий в испражнениях. Наиболее интенсивно цисты выделяются в течение первых 4-5 дней болезни, через 2-3 дня после остановки поноса выделение прекращается. Очень редко ооцисты удается обнаружить в оформленном стуле.

Верификация диагноза кринтоспоридиоза в большинстве случаев основана на обнаружении ооцист криптоспоридий в испражнениях и, значительно реже, в биоптате слизистой оболочки тонкой кишки и других биоматериалах.

- Читать далее "Лечение и профилактика криптоспоридиоза"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 4.6.2020

Остались вопросы или замечания?

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.