Бактериоскопическая и бактериологическая диагностика лептоспир (Leptospira)

Все больные с клиническим диагнозом «лептоспироз» или подозреваемые в заражении этой инфекцией в обязательном порядке должны быть обследованы лабораторными методами в соответствии с действующими рекомендациями. В связи с тем, что клиническая дифференциальная диагностика дептоспирозов представляет значительные трудности из-за полиморфизма клинической картины, результаты лабораторного обследования являются решающими для подтверждения лептоспирозной этиологии заболевания. Кроме того, установление серогруппы возбудителя важно для проведения эпидемиологического обследования и целенаправленного поиска источника инфекции.

Современная лабораторная диагностика дептоспирозов основана на комплексе микробиологических и серологических методов, которые используются в различных комбинациях в зависимости от фазы заболевания и диагностических возможностей лаборатории. Материалом для исследования являются кровь, моча, спинномозговая жидкость больного, а при летальных исходах — паренхиматозные органы, грудной и брюшной транссудат.

В период лептоспиремии (первая неделя болезни) для обнаружения лептосгшр можно использовать микроскопию нитратной крови, посев крови, определение специфической ДНК лептоспир в крови методом ПЦР и заражение лабораторных животных.

С конца первой, начала второй недели в крови больных появляются специфические антитела, которые можно определить при помощи серологических реакций — микроагглютинации лептоспир (РМА), агглютинации на стекле (РА), иммуноферментного анализа и других методов.

Начиная со второй недели исследуют ликвор, с третьей недели — мочу. В случае летальных исходов — паренхиматозные органы на присутствие лептоспир (микроскопия, посев, ПЦР, биопробы).

а) Метод прямой микроскопии. Лептоспиры плохо воспринимают окраску, поэтому все наблюдения проводят с живыми возбудителями в темном ноле зрения микроскопа. С этой целью используют конденсор темного поля (например, ОИ-13) и осветитель ОИ-19 или другой системы.

Для выявления лептоспир методом микроскопии готовят препараты «раздавленная капля»: небольшую каплю исследуемого материала наносят пастеровской пипеткой на предметное стекло толщиной не более 1,0-1,1 мм и накрывают покровным стеклом толщиной 0,2 мм. На верхнюю линзу конденсора микроскопа помещают каплю дистиллированной воды.

Ввиду значительной величины микроба для исследования пользуются сухими системами: объектив — х40, окуляр — х 10. Методом микроскопии исследуют нитратную кровь, мочу или ликвор больного, а также ткань паренхиматозных органов трупа.

Для приготовления нитратной крови смешивают 2 объема крови и один объем 1,5%-ного раствора лимоннокислого натрия; смесь отстаивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Микроскопируют надосадочную жидкость. Более эффективна подготовка материала способом двойного центрифугирования. На первом этапе проводят осаждение эритроцитов при 3000 об/мин в течение 15 мин. На втором этапе полученную надосадочную жидкость центрифугируют 30 мин при 10 000 об/мин. Полученный осадок микроскопируют.

Микроскопия цитратной крови — простой и доступный метод ранней диагностики лептоспироза. Однако следует помнить, что ввиду его низкой чувствительности (10ь клеток/мл) и кратковременности периода лептоспиремии (около 1 нед.) отрицательные результаты микроскопии нитратной крови не дают основания для исключения диагноза лептоспироза.

На фоне антибиотикотерапии диагностическая эффективность микроскопического метода резко снижается. Для подтверждения диагноза и определения серогруп-пы возбудителя, кроме микроскопии, необходимо проводить серологические и бактериологические исследования. Мочу (средняя порция) и ликвор исследуют в нативном состоянии. Более надежна микроскопия осадка, полученного после центрифугирования исследуемой жидкости при 10 000 об/мин в течение 15 мин.

Микроскопия мочи используется также с целью прижизненного обследования животных (в том числе свиней, собак и др.) на лептоспироносительство.

Ткань паренхиматозных органов (печень, почки и др.) берут пастеровской пипеткой и смешивают на предметном стекле с каплей физиологического раствора. Через 2-3 мин частицы ткани удаляют пинцетом, кайлю накрывают покровным стеклом и тотчас микроскопируют. Взвесь не должна быть слишком густой. При исследовании почек взвесь готовят из коркового слоя органа, в котором локализуются лептоспиры.

Сходным образом готовят препараты для микроскопии из почек грызунов и других животных при их исследовании на лептоспироносительство.

При микроскопических исследованиях следует учитывать следующие возможные ошибки:

- наличие в препарате образований (псевдоспирохет), по морфологии отдаленно напоминающих лептоспиры, — нитей фибрина, стромы эритроцитов и т.д.; от лептоспир их отличает отсутствие концевых крючков и активной подвижности;

- наличие в препарате других извитых форм микроорганизмов, например, спирилл, особенно часто обнаруживаемых при исследовании несвежего патологического материала;

- дефекты покровного стекла при неправильной настройке микроскопа могут быть ошибочно приняты за лептоспиры;

- плохое освещение препарата: при правильном освещении всегда видны пассивно или активно двигающиеся частицы.

Значительно реже для обнаружения лептоспир в органах и тканях используют окраску мазков-отпечатков по Романовскому-Гимзе, импрегнацию серебром гистологических срезов по Вартину-Стерри. С этой же целью можно использовать метод иммунофлуоресценции и полимеразную цепную реакцию.

б) Бактериологический метод служит для исследования того же материала и в те же сроки, что и метод микроскопии. Лептоспиры относятся к медленно растущим микроорганизмам, поэтому выделение культуры имеет значение только для ретроспективного подтверждения клинического диагноза лептоспироз и более детальной расшифровки этиологии случая или вспышки.

Исследуемый материал от больного — кровь, мочу, ликвор в количестве 5 капель засевают в 3-5 пробирок с питательной средой или стерильной дистиллированной водой, желательно у постели больного.

При посеве из органов трупа человека или павшего сельскохозяйственного животного (почек, печени) после вскрытия брюшной полости во избежание загрязнения посевов осторожно прижигают шпателем поверхность органа. Затем в этом месте производят прокол пастеровской пипеткой на глубину 0,25-0,5 см и забирают межтканевую жидкость с элементами ткани, которые с соблюдением всех правил асептики переносят в пробирку или ампулу с питательной средой.

Трупы грызунов в связи с быстрым развитием трупного обсеменения исследуют в первые часы (не позднее 12 ч в зависимости от температуры воздуха) после гибели зверька. Грызунов вскрывают при строгом соблюдении асептики. Шкурку зверька смачивают 5%-ной спиртовой настойкой йода. Стерильными инструментами производят вскрытие брюшной полости. Почку извлекают и помещают в стерильную чашку Петри. Затем небольшие кусочки ткани почки, взятые пастеровской пипеткой, засевают на питательную среду. Инструменты в процессе вскрытия обжигают.

Посевы следует производить в несколько (3-5) пробирок или ампул со средой, которые затем помещают в термостат и культивируют при температуре 28-30°С.

Для культивирования лептоспир используют жидкие сывороточные питательные среды, основным компонентом которых является сыворотка кролика или барана (среда Фервоорта-Вольфа и др., а также полусинтетические твин-альбуминовые среды. Иногда к жидким средам добавляют 0,1% агара, превращая их в полужидкие (см. 32.2.24).

Селективные среды. В качестве селективных могут быть использованы перечисленные выше жидкие питательные среды после добавления в них 5-фторурацила в концентрации 100 мкг/мл.

Контроль роста культуры. Лептоспиры размножаются в питательной среде, не изменяя ее внешнего вида. Среда остается прозрачной или слегка опалесцирующей в течение всего периода наблюдения. Поэтому для выявления роста лептоспир через 10 дней от момента посева из каждой пробирки или ампулы готовят «раздавленную каплю» и микроскопируют в темном поле.

Период инкубации для достижения оптимального роста обычно составляет 6-14 дней, но может варьировать от нескольких дней до 4 нед. и более. Температурный оптимум — 28-30°С, pH 7,2-7,6 (диапазон роста от 6,8 до 7,8). При выращивании клеток в пробирках с полужидкой средой (0,2% агара) на 1-3 см ниже ее поверхности образуются характерные плоские диски роста (феномен Дингера).

Для получения изолированных колоний лептоспир (например, с целью клонирования) к жидким питательным основам любого варианта добавляют 1%-ную агара (до автоклавирования) перед внесением сыворотки или альбуминовой добавки. 1% агаровую среду разливают в чашки Петри. На 1%-ной агаровой среде в чашках Петри лептоспиры образуют субповерхностные колонии. Плотные питательные среды на практике не используются.

Рост лептоспир в жидких питательных средах контролируют микроскопией, а также макроскопически — путем просмотра пробирок с культурами в луче света от осветителя. При осторожном встряхивании в питательной среде четко просматриваются опалесцирующие «муаровые» волны, образуемые выросшей культурой.

При обнаружении лептоспир в пробирках их содержимое засевают по 0,5 мл (10 капель) в 3 пробирки с 5,0 мл свежей питательной среды в каждой. Посевы помещают в термостат на 7-10 дней при температуре 28—30°С.

В случае получения хорошего роста (50-100 лептоспир в иоле зрения при увеличении х400) культуры используют как рабочие музейные штаммы (для последующей идентификации) и составляют на них паспорт.

Пробирки, где рост лептоспир не выявлен, вновь помещают в термостат и микроскопируют через каждые 10 дней. При отсутствии роста в течение 3 мес. результаты посевов считают отрицательными.

Штаммы хранят в соответствии с инструкцией по хранению патогенных микроорганизмов при комнатной температуре и пересевают 1 раз в месяц.

Аналогичным способом контролируют рост культур диагностических штаммов, предназначенных для серологических исследований.

Дифференциация патогенных и сапрофитических лептоспир проводится по результатам биопробы и культурально-биохимических тестов. Из них наиболее простыми являются выращивание культур при температуре 13°С или в присутствии 8-азагуанина в концентрации 225 мкг/мл. В отличие от патогенных сапрофитические лептоспиры в этих условиях хорошо размножаются.

С этой же целью можно использовать ПЦР тест-системы с различной таксономической специфичностью.

в) Определение чувствительности к антибиотикам не имеет практического значения. Лептоспиры высокочувствительны к тетрациклинам, пенициллинам, макролидам и многим другим антибиотикам. Штаммы, устойчивые к обычно применяемым антибиотикам, не описаны.

- Читать далее "Биологический метод диагностики лептоспир (Leptospira)"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 7.2.2020

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.