Серологическая диагностика лептоспир (Leptospira)

Серологические исследования — основа лабораторной диагностики лептоспирозов. В мировой практике для выявления антител золотым стандартом является реакция микроагглютинации лептоспир (РМА), отличающаяся уникальной специфичностью и высокой чувствительностью. Кроме того, РМА позволяет определить серогруппу возбудителя, что важно для последующего проведения эпидемиологического обследования.

Агглютинины в сыворотке крови больных лептоспирозом обнаруживаются в низких разведениях (1:20) начиная с 4-го дня, но чаще на 7-8-й день болезни. Титры антител достигают максимума, как правило, на 14-17-й день, а затем постепенно снижаются. Однако у некоторых больных, например, при тяжелом клиническом течении лептоспирозной инфекции, особенно на фоне интенсивной антибиотикотерапии, наблюдается иммуносупрессия (серогенативные случаи) или отсроченный синтез специфических антител, которые появляются лишь спустя 2-3 мес. от начала болезни.

Это важное обстоятельство необходимо учитывать при оценке результатов лабораторной диагностики спорадических случаев лептоспирозов (особенно иктерогеморрагического), когда выявляются в основном клинически тяжелые случаи. Агглютинины в сыворотке крови переболевших лептоспирозом обнаруживаются в течение 3-5 лет и даже в более отдаленные сроки после перенесенного заболевания, что используется для ретроспективной диагностики и изучения иммунологической структуры населения.

В случаях спорадических заболеваний сыворотку больных необходимо исследовать в динамике не менее двух раз: первый — при поступлении больного в стационар (даже если это первый день болезни), второй — через 5-7 дней. При необходимости исследование можно повторить на 3-4-й неделе болезни. Нарастание титров антител даже в невысоких разведениях (первое отр. и второе — 1:20) является абсолютным доказательством наличия заболевания.

У больных с типичной клиникой леитоспироза, характерным эпидемиологическим анамнезом, но отрицательными результатами серологического исследования, последнее следует повторить перед выпиской из стационара, а иногда, особенно при наличии поздних осложнений, в процессе диспансерного наблюдения за рекон-валесцентом в течение 3-6 мес.

При вспышке леитоспироза достаточно однократного исследования. При этом подтверждением лептоспирозной этиологии вспышки служит выявление у больных и переболевших антител в титрах от 1:100 и выше (соответственно срокам болезни).

Для постановки РМА используют живые культуры лептоспир 6-14-дневного возраста плотностью не менее 5х107— 108 клеток/мл (50-100 лептоспир в поле зрения микроскопа при увеличении х400) с хорошей подвижностью клеток, без спонтанной агглютинации и посторонних примесей (осадок, контаминация посторонней микрофлорой).

Каждую сыворотку исследуют со всеми референтными штаммами, представляющими серогруппы патогенных лептоспир, циркулирующих в данной местности. Для диагностики леитоспироза на территории Российской Федерации рекомендован стандартный набор диагностических штаммов лептоспир. Международный набор референс-штаммов, рекомендуемый для использования в специализированных лабораториях лептоспирозов, дополнительно содержит штаммы серогрупп лептоспир, ранее не выделявшихся на территории России.

При серологическом исследовании используют нативную сыворотку, консервированную (например, тиомерсагом натрия в разведении 1:10 000) или без консерванта.

В РМА можно также исследовать пробы крови больных людей или животных, высушенные на фильтровальной бумаге. Б этом случае кровь в количестве 2 капель (каждая размером 15-20 мм) наносят на фильтровальную бумагу и высушивают на воздухе. Для постановки реакции эти участки фильтровальной бумаги вырезают, разрезают и опускают на дно пробирки. В пробирку добавляют 10 капель физиологического раствора и оставляют на 1 ч при комнатной температуре. Полученный раствор служит основным разведением 1:10, из которого готовят последующие разведения.

Исследовать сухие капли необходимо в срок, не превышающий 1 мес. с момента взятия крови при условии хранения их при комнатной температуре и в течение 6 мес. при хранении в запаянном полиэтиленовом пакете в холодильнике при +4°С.

Для постановки РМА сыворотку больного исследуют одновременно в двух разведениях 1:10 и 1:100 (при смешивании с культурой получится 1:20-1:200), чтобы исключить феномен прозоны (зона задержки при избытке антител). В случае положительной реакции определяют конечный титр сыворотки.

При вскрытии трупов грызунов кровь берут из сердца пастеровской пипеткой. Сыворотки грызунов исследуют сначала в одном разведении — 1:10 (с культурой — 1:20) и титруют с двукратным шагом, если реакция положительная.

Разведенная сыворотка и живая культура лептоспир из диагностического набора штаммов смешиваются в равных объемах (по 0,1 мл) в лунках полистироловых планшет. В качестве контроля используют смесь равных объемов физиологического раствора и культуры лептоспир. Планшеты встряхивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре, после чего проводят окончательный учет реакции в препаратах «раздавленная капля» под микроскопом в темном поле (при увеличении х200 или х400). Вследствие добавления к испытуемой сыворотке равного объема живой культуры лептоспир разведение сыворотки удваивается.

При массовых серологических исследованиях, особенно сывороток животных, РМА удобно ставить сразу на предметном стекле, на котором смешивают по 1 капле разведенной сыворотки и культуры диагностических штаммов лептоспир.

Смесь накрывают покровным стеклом и после 15-минутной экспозиции при комнатной температуре проводят учет реакции под микроскопом. На каждом стекле можно поставить три реакции.

Агглютинация проявляется в форме склеивания лептоспир и образования своеобразных конгломератов в виде «паучков», «бантиков», «кос».

Учет реакции проводят визуально по условной системе оценок в виде трех крестов:

Контроль: агглютинация отсутствует, все клетки лептоспир находятся в свободном состоянии:
+ — примерно 1/3 лептоспир (по сравнению с контролем) агглютинирована;
++ — от 1/3 до 2/3 лептоспир агглютинированы;
+++ — агглютинированы почти все или все лептоспиры.

При исследовании сывороток крови больных и переболевших людей и анализе результатов серологических исследований примерно в 60% испытуемых образцов, особенно на 1-2-й неделе заболевания, наблюдаются межгрупповые реакции, затрудняющие установление этиологического агента.

Например, исследуемая сыворотка больного агглютинировала штамм М-20 (серогруппа Icterohaemorrhagiae) до разведения 1:200, штамм Pomona (серогруппа Pomona) — до 1:1600 и штамм Perepelicin (серогруппа Tarassovi) — до 1:100. Следует сделать заключение: лептоспироз, обусловленный возбудителем серогруппы Pomona.

Если же сыворотки больных реагируют только с одним из диагностических штаммов, также ставят серогрупповой диагноз. Например, в сыворотке больного обнаруживают антитела к штамму Moskva V в разведении 1:800. Диагноз: лептоспироз, вызванный лептоспирами серогруппы Grippotyphosa.

В ряде случаев в первые дни болезни титр антител к неспецифическому возбудителю превышает таковой к этиологическому агенту заболевания (парадоксальные реакции), но на более поздних сроках выявляются только специфические антитела к возбудителю болезни. Например, при лептоспирозе, вызываемом лептоспирами серогруппы Pomona, в первые дни болезни часто обнаруживаются антитела только к лептоспирам Australis, титр которых быстро снижается. Исследование парных сывороток помогает установить серогруппу возбудителя.

Для суждения об истинной роли той или иной серогруппы лептоспир в качестве этиологического агента у конкретного больного иногда прибегают к определению класса антител. При этом исходят из того, что антитела класса IgG отличаются большей специфичностью, чем IgM и в 85% случаев реагируют только с гомологичным антигеном.

Идентификация и хранение культур лептоспир (Leptospira)

Реакция агглютинации на стекле (слайд-агглютинации). С целью серологического скрининга и ранней диагностики лептоспирозов используются также более простые тесты (реакция слайд-агглютинации, иммуноферментный анализ и др.) с родоспецифическими антигенами лептоспир.

Реакцию агглютинации (РА) на стекле ставят для обнаружения антител к лептоспирам различных сероваров и серогрупп в сыворотке крови больных лептоспирозом, используя коммерческие родоспецифические препараты антигенов. Обычно РА используется для предварительного тестирования сывороток больных с подозрением на лептоспирозную инфекцию и массового скрининга. Техника постановки реакции проста, поэтому она может быть использована в лабораториях любого уровня оснащенности, в том числе и в клинических.

Ставят реакцию следующим образом.

1. На чистое предметное стекло автоматической пипеткой наносят 10 мкл испытуемой сыворотки, разведенной физиологическим раствором в соотношении 1:1, и 10 мкл антигена (после встряхивания виалы). Сыворотку и антиген смешивают бактериологической петлей. В качестве антигена используют коммерческий диагностикум (слайд-антиген), содержащий концентрированную взвесь лептоспир, убитых нагреванием.

2. Спустя 2-4 мин в проходящем свете осветителя ОИ-19 или при помощи вогнутого зеркала проводят оценку реакции: при положительном результате наблюдается образование четко видимых агглютинатов при одновременном просветлении реакционной смеси.

3. Если реакция агглютинации на стекле положительна или сомнительна, то сыворотку рекомендуется исследовать дополнительно в РМА.

Контроли:

1. Положительная контрольная сыворотка, которая дает четкую агглютинацию с антигеном в реакции агглютинации при постановке указанным методом.

2. Контроль антигена — антиген смешивается с физиологическим раствором в указанных выше соотношениях.

Испытуемые сыворотки должны быть свободны от контаминации и консервантов.

- Читать далее "Лечение и профилактика лептоспироза"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 7.2.2020

Остались вопросы или замечания?

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.