Микробиологическая диагностика стрептококков (Streptococcus)

Микробиологическую диагностику стрептококковых инфекций проводят с использованием следующих методов:
• микроскопического;
• классического бактериологического метода, основанного на выделении чистой культуры и ее идентификации;
• экспресс-идентификации антигенов стрептококков;
• молекулярно-генетических;
• серологических.

Микропрепараты, приготовленные из исследуемого материала, окрашивают по Граму, определяют морфологию и тинкториальные свойства. Следует указать что, несмотря на кажущееся единообразие форм, у каждого вида стрептококков есть свои морфологические особенности, касающиеся размера кокков, их формы, длины цепочек. Лица, длительно работающие с этими бактериями, почти безошибочно могут определить их вид при микроскопическом исследовании.

Экспресс-идентификация. Известно, что исход болезни пациента часто зависит от быстроты выявления возбудителя. При обнаружении в исследуемом материале стрептококков при необходимости проводят экспресс-идентификацию, позволяющую установить серологическую группу возбудителя. Методы основаны на определении различий в антигенной структуре полисахаридов и тейхоевых кислот клеточной стенки у разных видов стрептококков. Для этой цели используют групноспецифические гипериммунные кроличьи антистрептококковые сыворотки или иммуноглобулины G, адсорбированные на поверхности латексных частиц (реакция латекс-агглютинации — РЛА) или штаммов S. aureus, имеющих белок А (реакция коагглютинации).

В настоящее время для клинических лабораторий доступны на коммерческой основе тест-системы отечественного производства «АКВАПАСТ» (С.-Петербург) для экспресс-идентификации стрептококков серогрупп А, В, С и G в реакции коагглютинации. Исследование проводят в соответствии с Инструкцией по применению тест-системы. Важным преимуществом системы «АКВАПАСТ» является возможность получать антиген непосредственно с тампона, содержащего исследуемый материал, что сокращает время и позволяет провести анализ непосредственно у постели больного.

Латексная тест-система линии Pastorex® Strept А, В, С, D, F, G позволяет в течение 15-17 мин определить серогруппу гемолитических стрептококков, выросших на кровяном агаре. Эта тест-система содержит 6 флаконов-дозаторов с латексной суспензией по числу исследуемых серогрупп, дегидратированный фермент для экстракции антигенов, положительные и отрицательные контроли. Из выросших на кровяном агаре колоний стрептококков готовят антигены в соответствии с Инструкцией по применению тест-системы. Затем суспензию антигена соединяют с латексными диагностикумами и через 1 мин считывают результаты. Чтение результатов существенно облегчается благодаря использованию в реакции двухцветной латексной эмульсии: красная агглютинация на белом фоне — положительная реакция; коричневая гомогенная суспензия — отрицательная реакция.

Таким образом, идентификацию стрептококков указанных серогрупп в латексной тест-системе линии Pastorex® проводят на основании определения двух важнейших признаков: β-гемолиза на кровяном агаре с эритроцитами барана и обнаружения группоспецифических антигенов клеточной стенки бактерий.

Следует иметь в виду, что один и тот же групповой антиген может выявляться у разных видов стрептококков (Facklam, 2002), что ограничивает возможности методов экспресс-идентификации для видовой идентификации возбудителей. Чувствительность их, как правило, ниже, чем классических бактериологических. Результаты экспресс-тестов требуют обязательного подтверждения культуральными методами.

Несерологические методы идентификации, относящиеся к молекулярно-генетическим, разработаны в основном для типирования штаммов стрептококков групп А и В.

Бактериологический метод исследования («золотой стандарт») является наиболее важным в диагностике. В его основе — выделение чистой культуры стрептококков, идентификация культуры по биологическим и ферментативным свойствам, определение чувствительности к антибиотическим препаратам. Одновременно определяют количество стрептококков в образце исследуемого материала по числу колониеобразующих единиц (КОЕ).

В зависимости от клинических проявлений при подозрении на стрептококковую инфекцию проводят взятие определенного материала для микробиологических исследований. Это может быть:
• кровь из локтевой вены при развитии сепсиса или эндокардита;
• налет и слизь с миндалин и слизистых оболочек носоглотки при инфекции верхних дыхательных путей;
• гной и серозная жидкость из ран и поражений кожи;
• мокрота, бронхиальные смывы и пунктаты при поражении нижних дыхательных путей;
• спинномозговая жидкость при развитии менингита, полученная при люмбальной пункции;
• моча при инфекции мочевых путей.

Правила взятия и доставки клинического материала для проведения бактериологического исследования при стрептококковых инфекциях, этапы проведения бактериологического анализа, необходимые питательные среды и техника посевов при использовании разного материала, полученного от больного, определение чувствительности выделенных культур к антибактериальным препаратам аналогичны описанным для S. pyogenes серогруппы А и подробно изложены в отдельных статьях на сайте.

Для выделения стрептококков из исследуемого материала используют неселективные бульонные, агаровые и селективные питательные среды. Неселективные стандартные питательные среды:
• бульон Тодда-Хьюитта с добавлением 20% нормальной телячьей или лошадиной сыворотки или 3-5 % дефибринированной бараньей, лошадиной или кроличьей крови (кровяной бульон);
• агар Тодда-Хьюитта с добавлением 5 % крови (чаще — бараньей);
• триптиказо-соевый агар с кровью (5-10%);
• питательная среда для выделения гемокультур и культивирования стрептококков (НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова РАМН — Кн. II, с. 1045);
• «среда со стаканчиком» для выделения гемокультуры.

Для увеличения высеваемости стрептококков из исследуемого материала можно использовать селективные среды, ингибирующие рост грамотрицательных микроорганизмов:
• колумбийский 5%-ный кровяной агар с колистином (10 мкг/мл) и налидиксовой кислотой (15 мкг/мл). Однако на этой среде могут давать рост стафилококки и коринебактерии;
• колумбийский 5 %-ный кровяной агар с колистином (10 мкг/мл) и оксолиновой кислотой (5 мкг/мл). На этой среде не растут стафилококки и коринебактерии;
• триптиказо-соевый агар с 5% крови барана с ко-тримоксазоном (23,75 мкг/мл сульфаметоксазола и 1,25 мкг/мл триметоприма). На этой среде не растет большинство представителей нормальной ротоглоточной флоры (зеленящие стрептококки, микрококки, стафилококки и нейссерии), благодаря чему облегчается выявление β-гемолитических стрептококков;
• кровяной агар с кристаллвиолетом рекомендуют использовать для посева материала с кожных покровов, из ран и носовой полости для подавления роста гемолизирующих стафилококков.

Результаты первичного посева исследуемого материала на чашки Петри с кровяным агаром определяются по числу колоний, окруженных зоной гемолиза. При этом используется следующая балльная шкала:
• если число КОЕ гемолитических стрептококков на чашке находится в пределах от 1 до 10, выставляется балл 1+;
• число КОЕ на чашке от 11 до 50 — обозначается баллом 2+;
• если это число превышает 50, ставится балл 3+;
• балл 4+ соответствует значительному преобладанию гемолитических стрептококков.

Подозрительные на стрептококк колонии отсевают на скошенный кровяной агар для получения чистой культуры и ее идентификации.

Видовую принадлежность стрептококков серологических групп А, С, D, F, и G определяют в чистой культуре по фенотипическим свойствам.

Для биохимической идентификации стрептококков этих же групп предложен набор «СТРЕПТОтест 16» (Pliva-Lachema Diagnostica s.r.o. — Чехия). Набор содержит 10 пластмассовых стриппированных пластинок с 96 ячейками, содержащими высушенные питательные среды и субстраты для 16-ти биохимических тестов. Дополнительно в комплекте имеются бумажные полоски с нанесенными на них субстратами для PYR-теста (выявляющего способность вызывать гидролиз L-пирролидонил-β-нафтиламида) и для VP-теста (реакция Фогеса-Проскауэра).

В этой тест-системе исследуют 24-часовую чистую культуру стрептококков. Последовательность манипуляций проводят в соответствии с Инструкцией по применению. Для определения вида выделенных стрептококков указанных серогрупп прилагается идентификационная таблица.

Более быстрые результаты можно получить, оценив характер гемолиза и используя скрининговые (предварительные) методы идентификации. Эти методы основаны на определении чувствительности к бацитрацину, оптохину, сульфаниламидам, на результатах PYR-, САМР-тестов и желче-эскулинового теста, исследования растворимости в желчи, устойчивости к высокой концентрации соли.

Бацитрациновый тест. Чувствительность к полипептидному антибиотику бацитрацину (получен из В. licheniformis) используют для дифференциации видов β-гемолитических стрептококков серогрупп А, С, D, G, D и негемолитических стрептококков.

Для постановки бацитрацинового теста берут полную петлю бульонной культуры или 3-4 колонии β-гемолитических стрептококков, густо рассеивают штрихом на чашку с кровяным агаром, бацитрациновый диск помещают в центр штриховой зоны и прижимают его к агару стерильным пинцетом. Чашку инкубируют 18-20 часов при 35-37°С. Наличие зоны ингибиции роста стрептококков вокруг диска с бацитрацином позволяет отнести штамм к группе А по бацитрацину.

При постановке теста следует соблюдать следующие условия:
• используются диски с содержанием 0,04-0,05 ME бацитрацина. Диски, содержащие 10 ME антибиотика, для этого теста непригодны, так как могут дать ложноположительные результаты;
• поверхность среды должна быть густо засеяна чистой культурой для получения роста в виде сплошного «газона»;
• каждую новую партию дисков испытывают с известными штаммами стрептококков группы А, чтобы выявить стабильность препарата (положительный контроль);
• тест считают положительным при наличии любой ширины зоны ингибирования роста микроорганизма.

Примерно 5-10% штаммов (3-гемолитических стрептококков, принадлежащих к серогруппам В, С, D и G чувствительны к бацитрацину так же, как штаммы группы А.

В дополнение к бацитрациновому тесту целесообразно определять чувствительность выделенных β-гемолитических стрептококков к ко-тримоксазолу — комбинации сульфаниламидов: триметоприму (1,25 мкг) и сульфаметазолу (23,75 мкг). Стрептококки группы А, чувствительные к низким концентрациям бацитрацина, резистентны к ко-тримоксазолу. К этим сульфаниламидам, как правило, чувствительны β-гемолитические стрептококки с непостоянной реакцией на бацитрацин, в связи с чем выполнение обоих тестов, аналогичных по воспроизведению, повышает надежность результатов.

Чувствительные культуры характеризуются образованием зоны задержки роста любой ширины вокруг диска бацитрацина, резистентные — наличием роста вплоть до краев диска. При этом культуры β-гемолитических стрептококков, чувствительные к бацитрацину и резистентные к ко-тримоксазолу, предположительно рассматриваются как стрептококки серогруппы А (СГА), а резистентность, отмеченная в обоих тестах, позволяет предположить, что исследованные стрептококки принадлежат к группе В. Чувствительность, выявленная в обоих тестах, или чувствительность только к сульфаниламиду и резистентность к бацитрацину позволяют рассматривать выявленные стрептококки предположительно как не относящиеся ни к группе А, ни к группе В.

С целью дифференциации β-гемолитических стрептококков параллельно с определением чувствительности к бацитрацину целесообразно оценивать результаты постановки PYR-теста.

PYR-тест основан на гидролизе L-пирролидонил β-нафтиламида или β-нафтиламид L-пироглутамовой кислоты (PYR) специфическим бактериальным ферментом α-пирролидонил-аминопептидазой стрептококка группы А. При этом образуется β-нафтиламин, который при соединении с реагентом N1N-диметил-аминоциннамальдегидом дает вишнево-красное окрашивание.

Широкий спектр PYR-положительных нестрептококковых микроорганизмов вызывает необходимость постановки этой реакции с чистой культурой.

Тест, описанный в начале 1980-х гг. Richard Facklam et al„ проводился на плотной агаровой среде и позволял получить ответ через 16-20 ч. В настоящее время существует несколько модификаций PYR-теста, существенно сокращающих время исследования и предусматривающих использование бумажных дисков или полосок фильтровальной бумаги, пропитанных PYR, агаровой или бульонной среды с добавлением в нее реактива PYR. Все необходимое для осуществления PYR-теста доступно на коммерческой основе.

PYR-тест на фильтровальной бумаге:
• часть колонии, подлежащей исследованию, наносят бактериологической петлей на поверхность фильтровальной бумаги или диска, пропитанных PYR-реактивом;
• добавляют каплю выявляющего реагента N, N-диметил-аминоциннамальдегида;
• положительный результат: появление ярко-красного окрашивания в течение 1-5 мин;
• отрицательный результат: изменения цвета не наблюдается либо отмечается желтое или оранжевое окрашивание.

Примерно 98 % исследуемых штаммов СГА дают положительную реакцию в этом тесте. Однако из β-гемолитических стрептококков серогрунпы А только S. pyogenes одновременно проявляет чувствительность к бацитрацину и является положительным в PYR-тесте. Другие β-гемолитические стрептококки могут быть положительны только в одном из указанных тестов (R. Facklam, 2002). Так например, отдельные штаммы S. suis, стрептококки серогрупп С и G и другие, редко встречающиеся виды животного происхождения (S. porcinus и S. iniae), способны давать положительный результат только в PYR-тесте, но проявляют резистентность к бацитрацину.

САМР-тест (названный в честь предложивших этот тест Christie, Atkins и Munch-Peterson) специфичен для стрептококков, синтезирующих внеклеточный белок («САМР-фактор»). Этот белок увеличивает зону гемолиза эритроцитов при взаимодействии с р-токсином S. aureus. На чашку Петри с 5% кровяным агаром засевают культуру стафилококка, продуцирующую р-токсин. Посев делают одним штрихом через центр чашки. Перпендикулярно к линии посева стафилококка, не доходя до нее, параллельными штрихами высевают 18-часовые бульонные культуры исследуемых штаммов стрептококков. На одной чашке Петри можно исследовать 4-6 штаммов стрептококков. Чашку Петри с посевами инкубируют 18-24 час. при 37°С. В положительном случае отмечают образование «клина» гемолиза эритроцитов (в форме «крыльев бабочки») в месте пересечения посевов стрептококка и стафилококка.

Ориентировочную идентификацию стрептококков серогруппы D проводят, используя тест на устойчивость к прогреванию при 60°С в течение 30 мин с последующим высевом на кровяной агар.

Для идентификации стрептококков группы Anginosus предложены коммерческие тест-системы. Например, система Fluo-Card Milleri (Key Scientific, Round Rock, Tex.), включающая β-D-фукозидазу, β-глюкозидазу, а-глюкозидазу, позволяет быстро идентифицировать 88-98% стрептококков этой группы. Тест-система ID-32 Strep («Bio Merieux», Франция) включает N-ацетил-р-глюкозоамидазу, β-глюкозидазу и р-галактозидазу.

Исследование мочи при подозрении на стрептококковую инфекцию мочевыводящих путей включает следующие этапы: микроскопию мазков, окрашенных по Граму, проведение скрининговых тестов при выраженной бактериурии, выделение культур и их идентификацию, определение чувствительности к антибиотикам. Мочу от больных получают путем катетеризации, цистоскопии или собирают среднюю порцию при естественном процессе мочеиспускания, которую помещают в стерильную посуду. Пробы мочи должны быть доставлены в лабораторию в течение 2 ч или храниться в холодильнике при 4°С, но не более 18 ч до начала исследования.

Обнаружение даже одной клетки стрептококка в одном поле зрения микроскопа свидетельствует о наличии 105 или более микроорганизмов в 1 мл исследуемого образца. Присутствие одного или более лейкоцитов в одном поле зрения микроскопа является характерным признаком инфекции мочевого тракта.

Посев мочи делают на кровяной агар, инкубируют при 37°С, проводят идентификацию выделенных культур. Фирмой «Sanofi diagnostic Pasteur» для быстрой идентификации стрептококков серогруппы D и других бактерий, вызывающих инфекции мочевых путей, предложена тест-система «URISELECT 3®». В состав этой тест-системы включены хромогенные субстраты для контроля ферментативной активности β-глюкозидазы (эскулиназы), которую могут секретировать стрептококки группы D. При взаимодействии этого фермента с хромогенным субстратом происходит окрашивание колоний стрептококков синим цветом.

Определение чувствительности к антибактериальным препаратам (АБП) стрептококков, которые относят к нормальной микрофлоре и выделяют из естественных биотопов организма, считают нецелесообразным. Однако, если представители серогрупп А, С, D, G или F выделяют из первично стерильных жидкостей (кровь, ликвор), полостей, органов или тканей человека, то исследования на чувствительность к АБП проводят после выделения чистых культур в соответствии с Методическими указаниями (МУК 4.2.1890-04). В иных случаях проведению исследований на чувствительность к АБП должно предшествовать определение клинической значимости выделенных бактерий.

В клинической практике используют методы серийных разведений (МСР) и диско-диффузионные методы (ДДМ). МСР позволяют определить минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) АБП в жидкой или плотной питательной среде. В клинической практике чаще всего используется ДДМ. При проведении ДДМ посев стрептококков проводят на одну из следующих сред: питательный агар Мюллера-Хинтона, среду АГВ или агар ДОЧ (диагностический агар для определения чувствительности бактерий к антибиотикам). Во все эти среды вносят дополнительно 5-7% дефибринированной крови барана.

Известно, что β-гемолитические стрептококки сохраняют высокую чувствительность к β-лактамным антибиотикам и ванкомицину. Так, например, большинство изолятов стрептококков группы Anginosus высокочувствительны к пенициллину G. Цефалоспорины первого, второго (цефуроксим), третьего (цефподоксим), четвертого (цефепим) поколения проявляют высокую активность в отношении этих стрептококков.

При выделении стрептококков серогрупп А, С, D, F и G из стерильных локусов необходимо определять чувствительность к макролидам (эритромицину), линкозамидам (клиндамицину), хлорамфениколу и левофлоксацину. Это обусловлено нарастанием резистентности стрептококков к эритромицину и хлорамфениколу. Например, некоторые штаммы S. equi толерантны к пенициллину и эритромицину.

В таблице ниже приведены критерии интерпретации результатов определения чувствительности Streptococcus spp. (кроме S. pneumoniae) к антибиотическим препаратам.

Микробиологическая диагностика стрептококков (Streptococcus)

- Читать далее "Стрептококки серогруппы В: биология и микробиологическая диагностика"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 14.3.2020

Остались вопросы или замечания?

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.