Стрептококки серогруппы В: биология и микробиологическая диагностика

Стрептококки серогруппы В (СГВ) давно известны как возбудители мастита коров и мелкого рогатого скота и получили название Streptococcus agalactiae. До 1937 года включительно этот микроорганизм рассматривался как комменсал организма человека, пока R. М. Fry в 1938 не сообщил о семи случаях заболеваний и трех летальных исходах среди родильниц, связанных с СГВ-инфекцией. До 1960-х годов этот вид, как патоген человека, выделялся изредка при самых различных нозологических формах инфекции — при эндокардите, пиелонефрите, менингите, пневмониях, абсцессе, перитоните, родовом сепсисе, сепсисе новорожденных, фарингите и т.д. В течение 70-х и 80-х годов СГВ становится одним из частых возбудителей гнойно-септических инфекций у новорожденных и матерей в США и Западной Европе. В начале 90-х годов в нашей стране были также опубликованы материалы, подтверждающие роль этого вида стрептококков в патологии беременности и при гнойно-воспалительных заболеваниях новорожденных, а несколько позже была описана частота носительства штаммов СГВ в родильных домах различного типа среди родильниц и новорожденных.

Таксономия. Согласно современной номенклатуре, по определителю Bergey’s стрептококки этого вида входят в род Streptococcus семейства Streptococcaceae, вид S. agalactiae. В основе современной классификации стрептококков лежит введенное еще в 1933 г. Ребеккой Ленсфильд (R. С. Lancefield) деление на серологические группы в соответствии с наличием в глубоких слоях клеточной стенки группоспецифического антигена полисахаридной природы (С-субстанции). S. agalactiae отнесены к серогруппе В и являются ее единственными представителями.

Биологические свойства. Стрептококки серогруппы В обладают многими признаками, присущими всему роду Streptococcus. Они факультативные анаэробы. В аэробных условиях лучше растут при повышенной концентрации СО., в атмосфере. Температурный оптимум 37°С, pH 7,2-7,8. Клетки сферической формы 0,6-1,2 мкм в диаметре, при окраске по Граму — положительные. В мазках, приготовленных из бульонных культур, располагаются в виде цепочек, при росте на плотной среде наряду с цепочками, могут выявляться диплококки и небольшие скопления кокков. При выращивании на бульоне на поверхности не образуют пленку, рост может быть придонным, пристеночным, крупитчатым или в виде рыхлого осадка с сохранением полной прозрачности или помутнением бульона. Бензидиновый и каталазный тесты — отрицательные. Как и большинство представителей своего рода, СГВ плохо растут на обычных питательных средах, не обогащенных нативной кровью, сывороткой или глюкозой. Стрептококки этой группы на плотных средах, содержащих 5 % бараньей крови, растут в виде сероватых мукоидных колоний и в большинстве случаев вызывают просветление среды — бета-гемолиз вследствие лизиса эритроцитов.

Зона гемолиза у СГВ значительно уже и менее прозрачная, чем у стрептококков серогруппы А. Некоторые штаммы стрептококков группы В не гемолизируют эритроциты барана, другие образуют зону позеленения (альфа-гемолиз) вокруг колоний при росте на кровяном агаре. По целому ряду свойств СГВ аналогичны стрептококкам других видов. Они не растут при температуре ниже 10 и выше 45°С, а после прогрева при 60°С течение 30 мин погибают. Не редуцируют молоко с метиленовым синим? не расщепляют желатин, не ферментируют аргинин и ряд углеводов. В отношении устойчивости к повышенным концентрациям желчи (40%) или хлористого натрия (6,5%) в питательных средах наблюдения противоречивы. Здесь следует отметить, что многие исследователи сообщают о вариабельности биологических свойств у стрептококков. Для СГВ характерен также ряд специфических свойств: пигментообразование, способность гидролизовать гиппурат натрия, гемолиз в форме дуги при выращивании на кровяном агаре совместно с стафилококком, образующим бета-токсин (САМР-фактор) и наличие группоспецифического антигена.

В таблице ниже перечислены свойства СГВ, которые могут быть использованы для его дифференциации с близкородственными видами.

Устойчивость СГВ к факторам внешней среды, антибиотикам и фагам. Стрептококки группы В по устойчивости к факторам внешней среды близки к стрептококкам прочих серогрупп.

Наряду со стрептококками серогруппы А, стрептококки серогруппы В сохраняют свою чувствительность к пенициллину, хотя у штаммов СГВ в незначительном числе случаев отмечается устойчивость к пенициллину G. Помимо пенициллина, у стрептококков выявлена высокая чувствительность к ампициллину, эритромицину, клиндамицину, линкомицину, оксациллину и меропонему. Первые три поколения цефалоспринов, за исключением цефокситина и моксалактама, обладают более широким спектром активности по сравнению с пенициллином. Отмечена также высокая чувствительность СГВ к ряду сравнительно новых препаратов с широким спектром активности: к тиенамицину, мезлоциллину, азлоциллину и пиперациллину. У штаммов стрептококков группы В установлена частая устойчивость к аминогликозидам, налидиксовой кислоте, тетрациклину, хлорамфениколу, бацитрацину, триметоприму и метронидазолу. Тем не менее при сочетанном применении аминогликозидов с пенициллином или ампициллином в экспериментальных исследованиях на лабораторных животных выявлен синергетический эффект таких комбинаций.

При исследовании на небольшом числе штаммов СГВ, выделенных от рожениц и новорожденных в родильных домах г. Москвы, установлена высокая чувствительность к бета-лактамным антибиотикам, эритромицину, хлорамфениколу и линкомицину и низкая чувствительность к тетрациклину, стрептомицину и гентамицину. Следует отметить, что чувствительность к бета-лактамным антибиотикам высокая, но не абсолютная, как, например, у стрептококков группы А (СГА). Более того, в последние годы в зарубежной литературе появляются сообщения о выделении штаммов СГВ, устойчивых к бета-лактамным антибиотикам. Природу этого явления связывают с появлением в клетках микроорганизмов генов, ответственных за синтез пенициллин-связывающих белков. По данным ряда зарубежных исследователей, число штаммов СГВ, резистентных к эритромицину, может колебаться от 5,9 % до 32,0 %, а число штаммов, устойчивых к клиндамицину — от 6,9 до 14,3 %. По результатам наших исследований, в период с 2007 по 2010 годы отмечался рост числа устойчивых штаммов СГВ к ампициллину и эритромицину. Тактика применения антибиотиков для профилактики и лечения инфекции, вызываемой стрептококками группы В, будет описана ниже.

а) Фаги, активные против СГВ, впервые были изолированы Н. Russell с соавт. в 1969 году из штаммов, выделенных от коров. Позже фаги СГВ начали выделять из микробных культур человеческого происхождения. Были проведены работы по разработке систем для фаготипирования СГВ. Однако пока их применение в этих целях не получило широкого распространения. Известно, что литическая система фагов состоит из двух компонентов: холина и лизина. Холин разрушает клеточную мембрану и тем самым делает доступным внутриклеточный пептидогликан для его расщепления лизином. Были проведены обстоятельные исследования по выделению и изучению фаголизина СГВ. Предлагается применять фаголизин для выделения из клеток СГВ антигенов, которые используются для вакцинации животных при получении антительных диагностикумов. Установлено, что фаголизин СГВ не только подавляет рост идентичного вида, но и лизирует клетки стрептококков других серогрупп и тех видов микроорганизмов, которые содержат в своей клеточной стенке компоненты, чувствительные к фаголизину СГВ. Поэтому его рекомендуют применять как лечебное, а также как дезинфекционное средство.

Использование существующих отечественных бактериофагов в качестве лечебных средств, согласно нашим исследованиям, скорее всего, будет малоэффективно. Так, нами были изучена чувствительность бета-гемолитических стрептококков серогруппы А (318 штаммов) и серогруппы В (7037 штаммов) к стрептококковому, пиополивалентному и пиокомбинированному фагам. Все тестированные стрептококки были изолированы из различных органов амбулаторных пациентов в течение 2007-2010 г. Процент чувствительных штаммов колебался, в зависимости от примененного фага от 18,6% до 27,1 % для СГА и от 2,5% до 5,1 % для СГВ.

б) Антигенные свойства СГВ. Стрептококки серогруппы В — неоднородная популяция, состоящая из ряда серотипов и их сочетаний. Типоспецифические антигены также представляют собой полисахариды, расположенные поверхностно в виде капсулы, причем они различны у разных штаммов. Они состоят из глюкозы, галактозы, N-ацетил-глюкоза-амина и N-ацетил-нейраминовой кислоты (сиаловая кислота), различные сочетания которых определяют серологическую специфичность штаммов. В настоящее время выделено несколько серотипов, обозначаемых римскими цифрами от I до VIII. Тип I разделен на подтипы 1а и lb. Также идентифицирован подтип 1с, родственный подтипам 1а и lb по наличию полисахарида I, но отличный по белку. Помимо полисахаридных антигенов в капсуле ряда штаммов присутствуют белки С, R, и X. Эти белки встречаются в различных сочетаниях с серотиповыми полисахаридами, а иногда присутствуют в штаммах, утративших типоспецифический полисахарид, что позволяет идентифицировать по белковому антигену культуры, не типируемые по полисахаридному антигену.

В природе очень часто встречаются штаммы СГВ с сочетанием различных серотипов — серологические комбинации. Так, например исследования, проведенные в двух московских родильных домах, позволили выявить 17 серотипов и их комбинаций, среди которых преобладали Ia/c, Ib/c и Нс.

в) Факторы патогенности. Адгезия стрептококков группы В на слизистых оболочках является первым этапом колонизации и инвазии. СГВ могут прилипать к клеткам щечного эпителия новорожденных, к клеткам респираторного тракта, эндотелиальным клеткам, макрофагам, к клеткам слизистой влагалища и хориоамниотической мембране. Стрептококки могут проникать в эпителий хориона, который окружает плаценту. Это может привести к инвазии СГВ в плодный пузырь и последующему инфицированию плода. Штаммы СГВ, выделенные от больных новорожденных, лучше прилипают к эпителиальным клеткам, чем эти же микроорганизмы, выделенные от здоровых носителей. Выявленные особенности могут свидетельствовать о штаммовых различиях у стрептококков по способности вызывать заболевание. Существуют пока еще противоречивые мнения о роли различных поверхностных компонентов (липотейхоевые кислоты, белки, связывающие пластинки структуры стрептококка) в адгезивной активности СГВ. Несомненную роли в адгезии играют пили, отходящие от поверхности клеток.

Штаммы стрептококков группы В обладают различной способностью инвазировать легочные клетки организма человека. Основную роль в этом процессе играют бактериальные белки. В меньшей степени к этому причастны капсульные полисахариды бактерий. СГВ способны также проникать в макрофаги и полиморфно-ядерные лейкоциты. При этом установлено, что специфические опсонизирующие антитела не подавляют способность стрептококков к инвазии, хотя и значительно уменьшают время их внутриклеточного выживания.

Устойчивость к фагоцитозу представляет собой одно из свойств СГВ, которое позволяет штаммам этого вида выживать в условиях организма хозяина. Известно, что комплемент и типоспецифические антитела ответственны за переваривание стрептококков полиморфно-ядерными лейкоцитами. Бактериальные продукты интерферируют с комплементом и позволяют стрептококкам колонизировать слизистые оболочки и выживать. Существует также ряд других факторов патогенности: С5а-пептидазы, β-гемолизин и различные поверхностные белки (α, β, Rib, X, R). В частности, С5а-пептидаза нарушает хемотаксис полиморфно-ядерных лейкоцитов к месту СГВ-инфекции. β-гемолизин действует как фактор вирулентности при легочных инфекциях. Этот гемолизин способствует также проникновению стрептококков в эндотелиальные клетки сосудов ЦНС. СГВ выделяют гиалуронидазу, которая может способствовать распространению возбудителя в межклеточном пространстве плацентарной ткани.

В клетках стрептококков обнаруживают также САМР-фактор, протеазы и различные нуклеазы, однако их роль в патогенезе пока еще не ясна.

Отмечается также неравнозначная роль различных серотипов СГВ. В частности, установлено, что серотип III доминирует при тяжелых формах инфекции. Это связано с его высокой вирулентностью.

г) Клиническое значение и эпидемиологические особенности СГВ-инфекций. Стрептококки серогруппы В могут вызывать у людей тяжелые инфекции. Наиболее чувствительны к ним новорожденные, беременные женщины, больные диабетом, хронические больные, дети с дистрофией, пожилые люди, лица с пониженным иммунитетом. Со стрептококками группы В могут быть связаны такие заболевания у беременных женщин, как аборты в поздние сроки беременности, спонтанные аборты, хориоамниониты, пиелонефриты, инфекции мочеполовых путей, эндокардит, сепсис, а также осложнения после кесарева сечения, менингиты, маститы и эндометриты у рожениц.

По данным американских исследователей, в США ежегодно регистрируется приблизительно 50000 случаев хориоамнионитов и эндометритов, обусловленных стрептококками группы В. Эти инфекции чаще встречаются у женщин старшего возраста с пониженной способностью к деторождению, у женщин, имевших многочисленных половых партнеров в последние 12 месяцев до заболевания и с кандидозной колонизацией слизистой оболочки влагалища. В свою очередь, не было установлено связи между генитальными инфекциями, вызванными хламидиями, уреоплазмами и трихомонадами, и частотой колонизацией СГВ.

д) Носительство стрептококков у женщин. Носительство СГВ часто сочетается с рядом клинических симптомов: покраснением наружных половых органов, ороговением эпителия слизистой влагалища, гнойным влагалищным отделяемым и повышением pH влагалища (более 5,0). Считается, что основной локализацией СГВ в организме женщины является прямая кишка, откуда происходит контаминация влагалища. Желудочно-кишечный тракт — основной резервуар СГВ. Колонизация влагалища, как правило, происходит асимитоматично и сопровождается развитием типоспецифического иммунитета с нарастанием его активности по мере увеличения возраста женщин. Это отчасти объясняет более частое выделение стрептококков у женщин молодого возраста по сравнению с лицами старшего возраста. Роль полового пути в передаче стрептококков представляется спорным, хотя ряд исследователей отмечают увеличение частоты выделения СГВ из влагалища женщин с большим число половых партнеров и у женщин, госпитализированных с венерическими заболеваниями. Стрептококки группы В также выделяют из зева и уретры мужчин и женщин. На частоту носительства оказывают влияние расовые различия (у темнокожих женщин чаще обнаруживается присутствие СГВ, чем у белых), число беременностей и фаза менструального цикла.

Носительство СГВ может быть хроническим, транзиторным и перемежающимся, что не всегда позволяет проводить эффективный скрининг во время беременности. Частота носительства СГВ у беременных женщин, по сведениям различных авторов, в зависимости от локализации возбудителя колеблется в очень широких пределах — от 2,0 до 80,0% обследованных.

е) Факторы риска для беременных женщин. Колонизация беременных бактериями СГВ часто бывает сопряжена с рядом осложнений — преждевременными родами, длительным безводным периодом, малым весом новорожденных, мертворожденностью.

По данным расширенного исследования без малого 14000 женщин, проведенного в США на базе семи медицинских центров, число преждевременных родов оказалось достоверно более высоким в группе рожениц, колонизированных во время беременности стрептококками группы В.

Установлено, что у женщин с положительной урокультурой СГВ чаще наблюдаются не только преждевременные роды, но и случаи длительного безводного периода.

К числу факторов риска развития послеродовых СГВ-инфекций у женщин относят кесарево сечение, пониженный уровень специфических антител, диабет, массивную колонизацию стрептококками, снижение общего иммунитета.

Присутствие стрептококков в урогенитальном тракте будущих матерей создает реальную угрозу возникновения инфекции у новорожденного. Так, у половины новорожденных, родившихся у разных матерей, колонизированных СГВ, наблюдается колонизация кожи или слизистых оболочек этим стрептококком. Колонизация происходит внутриутробно или во время рождения ребенка.

ж) Факторы риска для новорожденных детей. Нужно отметить, что из числа детей-носителей заболевает от 1 до 2,0%. Это зависит от целого ряда факторов, связанных с особенностями организма новорожденного и возбудителя. Существует точка зрения, что приобретенные от матери антитела могут защищать ребенка от заболевания.

Важную роль в развитии СГВ-инфекций у новорожденных детей играют факторы, предрасполагающие к заболеванию, так называемые «факторы риска». Последние условно можно разделить на две группы: (1) факторы, связанные с особенностями родов или колонизацией стрептококками матерей, и (2) факторы риска, имеющие непосредственное отношение к новорожденным.

К первой группе можно отнести присутствие СГВ на слизистой шейки матки у беременных женщин, массивность колонизации стрептококками (выделения патогена одновременно из нескольких обследованных локусов), случаи СГВ-инфекции у детей в анамнезе у рожениц, преждевременные роды, длительный безводный период, подъем температуры во время родов, хориоамнионит, бактериурия, обусловленная стрептококками группы В.

Ко второй группе отнесем факт и массивность колонизации новорожденных СГВ, недоношенность и малый вес при рождении, рождение посредством кесарева сечения, длительное внутриутробное инструментальное исследование плода.

Особую опасность СГВ представляют для детей в перинатальном и неонатальном периоде их развития, вызывая у них такие заболевания, как пневмония, менингит, сепсис, остеомиелит, конъюнктивит, отит, омфалит, артрит, ангина и нейтропения.

Показатель заболеваемости у новорожденных, по данным разных авторов, колеблется от 0,4 до 5,0 на 1000 живых младенцев. В настоящее время стрептококки серогруппы В являются ведущим возбудителем и причиной смерти при перинатальной инфекции в США, Канаде, Великобритании, Испании. В Австралии ежегодно диагностируют сепсис, обусловленный СГВ, в среднем у 4 из 1000 живых новорожденных. При этом заболеваемость среди аборигенов составляет 5,2 против 1,7 у белых переселенцев.

Различают две формы заболеваний новорожденных — рано и поздно развивающиеся. При первой форме, на которую приходится приблизительно 80% СГВ-инфекций, у новорожденных чаще всего возникает сепсис, менингит, пневмония или нейтропения. Заражение при этой форме инфекции происходит внутриутробно перед родами через разорванную стенку плодного пузыря или во время родов при прохождении плода по родовому каналу, колонизированному СГВ. Хотя колонизация детей достигает приблизительно 50%, заболевание развивается только у 1-2% новорожденных. Начальные симптомы обычно проявляются в течение первых 12 часов после рождения и включают в себя нарушение дыхания, апноэ, понижение артериального давления и диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови. В отдельных случаях заболевание может развиться лишь к концу первой недели жизни. Летальные исходы обычно наблюдаются в первые 12-24 часа после рождения. Их частота может достигать 50-60% у нелеченных детей и в отсутствие профилактики заражения СГВ. Уровень заболеваемости при первой форме колеблется от 1,35 до 5,4 на 1000 новорожденных, частота осложнений центральной нервной системы — у 30-50% выживших детей.

Поздно развивающаяся форма заболевания — чаще всего менингит на фоне бактериемии, на которую приходится до 20 % заболеваний — проявляется в течение недели, иногда трех месяцев после рождения ребенка. В отдельных случаях — до 8 месяцев. Хотя инфекция протекает не так тяжело, как при первой форме, но летальность еще велика и колеблется от 5 до 15%. Среди основных симптомов — подъем температуры, летаргия, рвота и выбухание родничков. Кроме менингита, могут наблюдаться септические артриты, целлюлиты, остеомиелиты и бессимптомные бактериемии. Почти у 50 % новорожденных с этой формой инфекции в последующем наблюдаются неврологические осложнения.

з) Колонизация новорожденных СГВ в акушерских стационарах. Согласно современным представлениям, приблизительно половина новорожденных с поздней формой инфекции колонизируется СГВ при рождении, а остальная часть — от матерей, обслуживающего персонала или других источников.

Внутрибольничное заражение подтверждается рядом фактов: выделение стрептококков у детей при отсутствии возбудителя в родовых путях матери; групповые случаи выявления СГВ; начало заболевания примерно через неделю после родов. Выделение культур от медицинского персонала подтверждает его роль как резервуара стрептококковой инфекции. Типирование выделенных штаммов позволило прийти к заключению, что если мать является источником СГВ для одного ребенка, то для каждых трех других детей выявляется другой источник инфицирования.

Установлено, что СГВ могут циркулировать в акушерских стационарах от 2-6 недель до 15-18 месяцев.

и) СГВ-инфекция в стационаре для взрослых. Лабинской А.С. в 70-х годах наблюдался эксквизитный (уникальный) случай внутрибольничной инфекции, вызванной стрептококками серогрупиы В в стационаре Института ревматизма АМН СССР. Источником инфекции послужил больной ревматизмом, как потом выяснилось, носитель СГВ, поступивший в палату, где находились на плановом лечении пациенты, страдающие ревматизмом. В короткий срок все пациенты палаты и часть контактировавшего с ними медицинского персонала заболели ангинами. Инфекция протекала в тяжелой форме. Из зева у всех заболевших был выделен СГВ. Принадлежность стрептококка к группе В была доказана биохимическими и серологическими методами.

к) СГВ-инфекции у лиц пожилого возраста. По данным зарубежных исследователей, в последние годы отмечается относительный рост числа заболеваний, вызываемых СГВ, у пожилых лиц на фоне некоторого снижения заболеваемости среди новорожденных детей. Наблюдаемое явление связывают, с одной стороны, с активной профилактикой этой инфекции в родильных домах, а с другой — с увеличением числа пациентов пожилого возраста со сниженным иммунитетом. У последних СГВ обычно вызывают инфекцию кожи и костей, сепсис без явного источника его происхождения, уросепсис, пневмонию и перитониты. Нередко перечисленные инфекции возникают у таких пациентов повторно.

л) Микробиологическая диагностика инфекций, вызываемых стрептококками группы В. Микробиологическая техника в исследовании СГВ-инфекций представляет важный этап в ряду диагностических мероприятий. Своевременное выделение возбудителя во многом определяет эффективность лечения и профилактики этого заболевания. Можно выделить основные этапы в выделении и идентификации возбудителя.

1. Отбор клинического материала и начало исследований. Для выявления носительства СГВ у беременных женщин исследуют мазок со слизистой влагалища и прямой кишки на 35-37 неделе беременности. Если нет возможности провести посев сразу, тампоны с мазками следует поместить в транспортную среду (например Эймиса или Стюарта). При подозрении на клиническую инфекцию исследуют следующие пробы: кровь, спинномозговую жидкость, мокроту, плодную жидкость, суставную жидкость, фрагменты пораженных тканей. Материал засевается непосредственно на плотные питательные среды. При выявлении носительства СГВ тампоны с мазками параллельно целесообразно посеять в селективный накопительный бульон для увеличения вероятности выделения возбудителя (см. раздел 5.2 в настоящем томе) При этом материал из прямой кишки и влагалища можно засевать на одну пробирку, так как неважно, откуда будет выделен возбудитель. Пересев с бульона на плотную среду делают на следующий день. В качестве плотных питательных сред обычно используют питательные агары с 5 % бараньей крови, а в качестве жидкой накопительной среды — питательные бульоны с антибиотиками (раздел 5.2). Наиболее часто за рубежом используют бульон Тодда-Хьюитта (раздел 5.2), содержащий два антибиотика: гентамицин и налидиксовую кислоту.

Клинический материал лучше всего засевать на питательные среды сразу после его взятия. Промежуток времени от отбора до момента посева материала не должен превышать двух часов в случае хранения его при комнатной температуре.

2. Просмотр чашек Петри с посевами и предварительная идентификация СГВ. Через 18-24 часа инкубации при 37°С учитывают результаты прямого посева на чашках с кровяным агаром. При наличии мелких (1-1,5 мм в диаметре) круглых беловато-серых колоний, окруженных зоной бета-гемолиза, ставят тест на выявление каталазы. При отсутствии каталазы колонии, похожие на стрептококковые, подвергают дальнейшей идентификации. Если бета-гемолитические колонии не выявлены в прямом посеве, делают высевы с селективного накопительного бульона на чашку с кровяным агаром. Посевы еще раз инкубируют 18-24 часа при 37°С, после чего при наличии колоний, напоминающих СГВ, проводят дальнейшую идентификацию. Использование селективного накопительного бульона значительно повышает шанс выделения стрептококков и, следовательно, в большей степени гарантирует своевременную профилактику СГВ-инфекций.

3. Предварительная идентификация СГВ. Фактическая идентификация возбудителя начинается непосредственно на первичной чашке с кровяным агаром. Характер гемолиза является важным признаком для предварительной идентификации стрептококков. По типу гемолиза на кровяном агаре известны альфа-, бета- и гамма-гемолитические штаммы S. agalactiae. В патологии человека большее значение придается бета-гемолитическим штаммам СГВ, которые, в отличие от штаммов стрептококков группы А, образуют на поверхности агара с 5 % бараньей крови более узкую и менее четкую зону гемолиза. На проявление гемолитических свойств S. agalactiae большое влияние оказывают условия культивирования, состав питательных сред, их стандартность, содержание CO2 в атмосфере, вид используемой крови (баранья, кроличья, донорская человеческая, от крупного рогатого скота и др.), толщина кровяного агара в чашке Петри. Для выделения бета-гемолитических СГВ оптимальными плотными средами зарубежного производства являются «Триптиказо-соевый агар», и «Основа для кровяного агара» (BBL, Oxoid, bioMerieux и др.). При их недоступности можно использовать питательный агар или мясо-пептонный агар отечественного производства. Во все перечисленные среды следует добавлять 5 % нативной дефибринированной бараньей крови или крови крупного рогатого скота.

Толщина среды в чашке не должна превышать 4 мм. Посевы инкубируют в термостате при 37°С в течение 18-24 часов. Из колоний, напоминающих бета-гемолитические колонии стрептококков, делают мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют. Стрептококки, выросшие на плотной среде, иод микроскопом видны как грамположительные кокки, расположенные короткими цепочками, попарно или иногда в виде скоплений.

Одним из важных предварительных тестов для выявления стрептококков является определение каталазы. Весь род стрептококков не образует каталазы. Поэтому этот признак рассматривают как родовой. В присутствии каталазы происходит расщепление перекиси водорода на водород и воду. При наличии каталазы происходит выделение пузырьков водорода. В отсутствие каталазы пузырьки газа не образуются. Следует отметить, что рабочий раствор перекиси водорода быстро теряет свою активность и поэтому нуждается в постоянном контроле. Для этого можно использовать штаммы стафилококков, которые обычно характеризуются хорошей каталазной активностью.

К числу тестов, широко используемых для дифференциации стрептококков, относится САМР-тест. Он был предложен группой авторов в 1944 г. и назван по первым буквам их фамилий (Christiae, Atkins, Munch-Petersen). Суть теста сводится к синергичному литическому феномену — образованию штаммом СГВ на кровяном агаре прозрачного участка в форме дуги или клина в зоне действия стафилококкового бета-токсина. Тест осуществляют путем посева через центр по диаметру чашки сплошным штрихом культуры золотистого стафилококка, продуцирующего бета-токсин, а перпендикулярно ему, сохраняя дистанцию в 1 -2 мм — испытуемую культуру стрептококка. Тест ставят на плотных средах с 5% нативной бараньей крови или кровью крупного рогатого скота. Образование гемолитической дуги или клина на стыке посева культур стафилококка и стрептококка после культивирования при 37°С в течение 18-24 часов считается положительной реакцией.

В последние годы рядом зарубежных исследователей предложено несколько экспресс-методов проведения САМР-теста с бета-токсином золотистого стафилококка или альфа-токсином Clostridium. В этих случаях токсин непосредственно наносится на область роста исследуемых колоний стрептококков на первичной чашке. Через 20-30 минут наблюдается усиление зоны гемолиза в области нанесения капли токсина. Таким образом, экспресс-тесты позволяют провести предварительную идентификацию СГВ уже в первые сутки после посева клинического материала. Это имеет большое значение, когда ставится вопрос о своевременном начале химиопрофилактики СГВ-инфекции у женщин в последние недели беременности.

При использовании САМР-теста следует иметь в виду, что у небольшой части стрептококков группы А также выявляется положительный результат теста. Поэтому для дифференциации с этим видом целесообразно ставить тест на чувствительность к бацитрацину. Стрептококки группы А чувствительны к этому антибиотику, тогда как стрептококки группы В — не чувствительны. Тест ставится на поверхности кровяного агара, засеянного культурой изучаемого штамма стрептококка, путем накладывания диска с бацитрацином на поверхность среды. На следующие сутки зачитываются результаты. Зона задержки роста испытуемой культуры является признаком чувствительности штамма. Значимость ее размера обычно указывается в прилагаемой к препарату инструкции.

Другим тестом для предварительной идентификации СГВ служит гидролиз гиппурата натрия. Приблизительно 19,0% штаммов стрептококков группы D тоже могут гидролизовать гиппурат натрия. Поэтому параллельно с данным тестом изучаемую культуру целесообразно засевать на скошенную среду или чашку с желче-эскулиновым агаром. Стрептококки группы D растут в присутствии 40,0% желчи и гидролизуют эскулин в среде, что сопровождается ее почернением. СГВ же не растут в присутствии 40,0% желчи и не гидролизуют эскулин, так что цвет среды не меняется. Для повышения надежности этого теста следует использовать контрольный штамм стрептококка группы D.

В настоящее время в зарубежной практике используется также экспресс-метод, основанный на способности СГВ образовывать красно-оранжевый каратиноидный пигмент на питательных средах специального состава. В частности, используют специально разработанную коммерческую среду Granada agar (Oxoid), в которую входят протеозный пептон, растворимый крахмал, глюкоза, пируват, агар-агар, метотрексат натрия для усиления пигментации и колистин в качестве селективного агента. Клинический материал непосредственно засевается на чашку со средой и инкубируется в анаэробных условиях. До 95,0% стрептококков группы В удается выявить в течение 12 часов инкубации. Согласно описанию, тест с образованием пигмента обладает высокой специфичностью. Представители других серогрупп стрептококков не обладают способностью образовывать пигмент.

Для клинических микробиологов обычно бывает достаточно упомянутых тестов. Однако в сомнительных случаях, например, при несовпадении тестовых результатов, необходимо дополнительно проводить серологическую идентификацию стрептококков.

4. Серологические и молекулярно-генетические методы идентификации бета-гемолитических стрептококков. Серологические методы были впервые описаны Р. Ленсфильд в 1933 г. Для определения серогруппы в оригинальной методике автора в качестве антигена она предложила использовать кислотные экстракты клеточных стенок стрептококков. Экстракты смешивают в преципитационной пробирке с группоспецифической антисывороткой, полученной при иммунизации кроликов стрептококком, не содержащим типовых антигенов. Появление кольца преципитации на границе между экстрактом и гомологичной антисывороткой рассматривается как положительная реакция. В дальнейшем другими специалистами были предложены методы экстракции антигенов формамидом, при автоклавировании, азотистой кислотой, ферментом Streptomyces albus, «Проназой» и лизоцимом. Все перечисленные методы могут рассматриваться скорее в качестве исторической предтечи современных простых и наглядных тестов, для проведения которых применяются коммерчески доступные реагенты.

В настоящее время для серологической идентификации стрептококков применяют несколько методик, в которых используются целые клетки микроорганизмов из культуральных супернатантов или ферментативные экстракты бактериальных клеток. Наибольшее распространение получила техника коагглютинации и латекс-агглютинации. Первый метод основан на агглютинации стрептококков специфическими антителами, адсорбированными на поверхности убитых стафилококков, содержащих А-протеин («Аквапаст», С.-Петербург; «Phadebact», Швеция). Во втором методе вместо клеток стафилококков используют частички латекса. Принцип этого метода сводится к использованию в качестве антительного диагностикума кусочков латекса с адсорбированными на них специфическими групповыми антителами. Антигены извлекаются из клеток стрептококков с помощью ферментативного гидролиза и приводятся в соприкосновение с антисывороткой на латексных частичках. В случае их соответствия образуется хорошо заметный преципитат. Латексные диагноститикумы выпускаются рядом известных зарубежных фирм — «BioMerieux», «BioRad», OXOID и др.

С целью совершенствования методов лабораторной диагностики Streptococcus agalactiae в России в Центральном научно-исследовательском институте эпидемиологии Роспотребнадзора была также разработана тест-система (набор реагентов) для количественного выявления ДНК Streptococcus agalactiae из различного клинического материала методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» под названием «АмплиСенс® Streptococcus agalactiae-FL». В качестве клинического материала могут быть использованы соскобы из урогенитального тракта, мазки из ротоглотки, цельная кровь, ликвор. Тест-система позволяет оценить качество взятия клинического материала и контроль выполнения анализа при помощи эндогенного внутреннего контроля, в качестве которого используется участок ДНК гена β-глобина человека. Кроме того, с помощью данного набора возможно количественное определение ДНК микроорганизма. Оно основано на использовании стандартных образцов с известной концентрацией ДНК Streptococcus agalactiae. Преимуществом нового теста является то, что он позволяет выполнить исследование в течение нескольких часов и тем самым ускорить принятие клинических решений по профилактике и лечению заболевания. Количественный формат теста позволяет использовать метод для оценки степени колонизации СГВ выбранного локуса.

В настоящее время существует также целый ряд зарубежных ПЦР-тест-систем для выявления стрептококков группы В: «RiboSEQ GBS test» (Ирландия), «IDI-Strep В Assay» (Канада), «GeneXpert GBS» (США), «LightCycler Strep В» (США).

До недавнего времени серотипирование штаммов стрептококков являлось ведущим методом, позволяющим решать основные эпидемиологические задачи. Встречный иммуноэлектрофорез и методика Эллиса в микроплашках являются основными методами определения типовых антигенов в референс-лабораториях.

Недавно с помощью молекулярно-генетических методов были разработаны технологии серотипирования и субсеротипирования штаммов СГВ. К упомянутым технологиям следует отнести мультилокусное секвенирование-типирование (MLST), риботипирование, амплификацию со «случайными» олигонуклеотидами (RAPD), макрорестрикционный анализ в пульсирующем электрическом поле (PFGE), оценку полиморфизма фрагментов рестрикции (RELP), мультилокусный энзим-электрофорез (MLEE). Эти методы в отношении СГВ пока еще не получили широкого распространения, они не стандартизованы и носят экспериментальный характер. Тем не менее, их использование значительно расширяет возможности выявления генетического родства между изолятами СГВ по сравнению с серотипированием, позволяет различать штаммы одного и того же серотипа в пределах вида, способствует выявлению эпидемически значимых штаммов СГВ, уточняет источники и пути передачи возбудителя, полезно для анализа серологически нетипируемых штаммов.

м) Профилактические мероприятия. Важную роль в предупреждении СГВ-инфекции у новорожденных играют своевременные профилактические мероприятия. В настоящее время за рубежом наиболее высокую оценку с позиции эффективности получила практика использования антибиотиков, которые назначаются роженицам перед родами или во время родов при наличии ряда показаний. В качестве антибактериальных препаратов обычно используется пенициллин или ампициллин, а в случае аллергии к ним — тетрациклин, эритромицин или клиндамицин.

Американской коллегией акушеров и гинекологов и Американской академией педиатров разработаны рекомендации по профилактике с помощью антибиотиков СГВ-инфекций у новорожденных. Центром по борьбе с заразными болезнями США (CDC) был обобщен опыт названных ассоциаций и разработана стратегия по предотвращению развития ранних форм заболеваний новорожденных СГВ-инфекцией. Указания по проведению профилактических мероприятий, разработанные CDC, схематически представлены на рисунке ниже.

Стрептококки серогруппы В: биология и микробиологическая диагностика

По данным ряда зарубежных специалистов, в основном из скандинавских стран, среди профилактических мероприятий наиболее перспективной, с точки зрения ее эффективности, простоты применения и дешевизны, оказалась санация хлоргексидином. Показано, что местное применение препарата подавляет носительство СГВ во влагалище и уретре женщин, в 3-5 раз снижает риск возникновения инфекций, обусловленных стрептококками группы В и S. aureus, до 48 % снижает риск поступления детей в палату интенсивной терапии, уменьшает вероятность внутригоспитального распространения патогена. Однако, как показали исследования отечественных микробиологов, при санации влагалища рожениц водным раствором хлоргексидина невысокой концентрации (0,05%) не отмечается его существенного влияния на носительство СГВ. Тем не менее выявлен выраженный отрицательный побочный эффект, который проявляется в подавлении нормальной симбиотической микрофлоры влагалища, участвующей в обеспечении колонизационной резистентности его слизистой оболочки. Из этого сделано заключение, что использование хлоргексидина для санации женщин перед родами следует ограничить случаями, когда потенциальная опасность присутствия патогена превышает риск от последствий подавления колонизационной резистентности влагалища, например, при гонококковом или кандидозном кольпите у рожениц.

К сожалению, профилактика СГВ-инфекций у новорожденных детей с помощью химиопрепаратов и антисептиков не позволяет решить ряд других, не менее важных проблем. Среди них предупреждение поздних форм заболевания у детей, мертворожденности, преждевременных родов, профилактика заболеваний у взрослых с пониженной резистентностью. Следует отметить также еще ряд проблем, связанных с применением антибиотиков. Как уже указывалось ранее, отмечается постоянный рост числа штаммов СГВ, резистентных к бета-лактамным препаратам, а также к препаратам альтернативного ряда (эритромицину и клиндамицину), используемым при аллергии к бета-лактамам. Применение пенициллина во время родов может приводить к развитию аллергических реакций у новорожденных. Предполагается, что вакцинация женщин перед и во время родов может защитить новорожденных в перинатальный период благодаря трансплацентарной передаче материнских IgG-антител. Это позволило бы исключить необходимость профилактики антибиотиками и проведение предварительных исследований на носительство СГВ у беременных женщин. Установлено, что в естественных условиях у женщин с антителами к капсульному антигену СГВ отмечается хорошая защита от инфицирования стрептококками группы В.

У небеременных женщин, привитых капсулярным полисахаридным антигеном штамма СГВ, изолированного от больных, показана высокая иммуногенность и хорошая переносимость вакцины. Получены также обнадеживающие результаты при использовании для вакцинации женщин капсульного полисахарида, конъюгированного с белковым компонентом (столбнячным анатоксином), что приводило к продукции высокого уровня специфических антител, а в опыте на мышах защищало последних от летальной СГВ-инфекции. В настоящее время также ставится вопрос о необходимости вакцинации девочек, достигших пубертатного возраста, женщин репродуктивного возраста и маленьких детей. Можно сказать, что проблема вакцинации против инфекций, вызываемых стрептококком группы В, находится в стадии активной разработки.

- Читать далее "Альфа-зеленящие стрептококки: морфология, культуральные, биохимические свойства"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 14.3.2020

Остались вопросы или замечания?

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.