Определение нуклеотидных последовательностей (секвенирование или расшифровка), специфических для ДНК генома МБТ, (полная его расшифровка была закончена в 1998 г.) позволила использовать полимеразную цепную реакцию (ПЦР) как основу методики для выявления МВТ в различных диагностических материалах, дать характеристику специфическим участкам генома, ассоциированным с лекарственной устойчивостью, и разработать соответствующие коммерческие тест-системы (наборы реагентов), ряд которых зарегистрирован в России.

Для проведения анализа необходимо выделить ДНК микобактерий из клинического образца, затем провести ПЦР, оценить ее количественно или полуколичественно и получить результат в течение 2 ч.

Наряду с высокой аналитической чувствительностью исследований при выявлении М. tuberculosis в образцах (10-100 клеток в образце) ПЦР имеет важнейшее преимущество для клинической практики, заключающееся в краткосрочности (1-2 дня) проведения анализа. Диагностическая чувствительность ПЦР при исследовании образцов мокроты больных туберкулезом составляет в среднем 80%, а специфичность — 99%. Получение ложноположительных результатов при использовании технологии ПЦР в диагностике туберкулеза вызвана внутрилабораторной контаминацией в связи с тем, что продукты амплификации (фрагменты ДНК) могут при использовании гельэлектрофореза очень легко попадать в исследуемые образцы и служить матрицей для новых реакций. Однако развитие ПЦР-технологий и появление метода ПЦР в реальном времени резко уменьшило эту вероятность.

Метод ПЦР в реальном времени позволяет наблюдать результаты реакции на мониторе компьютера одновременно с проведением реакции в системе одной закрытой пробирки, в связи с чем продукты реакции не попадают во внешнюю среду. При этом используют флуорогенные ДНК-зонды, гибридизация которых приводит к измеряемому уровню флуоресценции пропорционально количеству продукта реакции. Таким образом, могут быть получены количественные данные о наличии М. tuberculosis в исследуемом клиническом образце.

ПЦР может быть использована для быстрой видовой идентификации микобактерий. В частности, при исследовании образцов жидкой среды после получения положительного сигнала в ускоренных системах культивирования микобактерий типа «Bactec» видовая идентификация МВТ может быть проведена при помощи ПЦР-рестрикционного анализа путем обработки продукта ПЦР (общего для микобактерий фрагмента ДНК) двумя рестрикционными ферментами с получением специфического набора фрагментов ДНК разной длины, определяемых с использованием маркера молекулярной массы ДНК в виде флуоресцирующих полос при агарозном гельэлектрофорезе.

Дифференциация М. bovis BCG и вирулентных видов МБТ осуществляется с использованием ПЦР-анализа с тремя праймерами, один из которых комплементарен участку ДНК, отсутствующему в вакцинном штамме.

Для видовой идентификации M.avium, M.intracellulare и других медленно растущих видов микобактерий, имеющих клиническое значение, может быть также использован метод гибридизации ДНК микобактерий с видоспецифическими ДНК-зондами (коммерческий набор Accu-Probe).

Молекулярно-генетические методы на основе ПЦР-анализа используются и для быстрого определения лекарственной чувствительности МБТ. Разработанные методы позволяют определять лекарственную устойчивость пока лишь в отношении рифампицина, изониазида и фторхинолонов с чувствительностью и специфичностью, применимыми для клинических исследований. В отношении других ПТП исследования носят научный характер.

Признаки лекарственная устойчивости могут быть определены путем считывания (секвенирования) последовательностей ДНК после амплификации в ПЦР участков генов, ответственных за лекарственную чувствительность. Однако этот метод весьма дорог.

Быстрое определение чувствительности М.tuberculosis в отношении некоторых ПТП может быть проведено также методом ПЦР в реальном времени. При этом используются флуорогенные ДНК-зонды или флуорогенные праймеры, комплементарные точкам мутаций, ответственных за возникновение лекарственной устойчивости. Реакция проводится в системе закрытых пробирок в одну стадию, а результаты оцениваются по увеличению флуоресценции при обнаружении лекарственной устойчивости.

Имеется также коммерческая тест-система INNO-LIPA фирмы «Innogenetics» для одновременного определения в клиническом образце наличия МБТ и наиболее часто встречающихся мутаций, ассоциированных с устойчивостью к рифампицину; она основана на гибридизации продуктов ПЦР с зондами на нитроцеллюлозной мембране.

В России получила распространение так называемая биочип-технология (НИИ молекулярной биологии РАН им В.А. Энгельгардта), с помощью которой проводят одновременно как выявление присутствия МБТ в клиническом образце, после ПЦР-амплификации видоспецифичного фрагмента IS611, так и определение мутаций в генах, ассоциированных с устойчивостью к изониазиду, рифампицину, офлоксацину при помощи гибридизации с короткими специфическими олигонуклеотидами. Результаты анализа оцениваются автоматически с помощью специального компьютеризированного прибора и хранятся в виде банка данных. Разработанные биочипы и тест-наборы позволяют провести скрининг категории больных туберкулезом с МЛУ и оценить у них устойчивость к фторхинолонам — важнейшему ПТП 2-го ряда. Чувствительность и специфичность метода для выявления этой категории больных составляет 95%.

Следует, однако, отметить, что молекулярные методы определения лекарственной устойчивости непосредственно из клинического материала (образцов мокроты) эффективны при значительном бактериовыделении, т.е. образцы должны быть положительными по результатам бактериоскопии. Другим ограничением является условие однородности популяции клеток МБТ в материале.

Штаммовая или внутривидовая идентификация МБТ для эпидемиологического мониторинга, основанная на молекулярно-генетическом анализе, пока остается технологией научных исследований, но ее практическое значение для контроля за туберкулезной инфекцией в конкретных регионах имеет очень большое значение уже в настоящее время.

Задачами молекулярной эпидемиологии Moiyr быть: определение региональных характеристик штаммов возбудителя туберкулеза с последующим изучением связей (общих черт) между региональными штаммами и возможным анализом переноса инфекции в данный регион; изучение микровспышки (случаев заболевания в группе контактировавших лиц) туберкулеза; изучение роли суперинфекции возбудителя туберкулеза в реактивации или рецидиве заболевания; определение возможности переноса инфекции в условиях фтизиатрического стационара; изучение роли переноса туберкулезной инфекции в распространении штаммов МБТ с множественной или экстенсивной лекарственной устойчивостью.

Наиболее признанным методом штаммовой идентификации МБТ является технология, называемая полиморфизмом длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ), которая основана на фрагментировании (рестрикции) ДНК микобактерий туберкулеза при помощи фермента Pvu II с последующей гибридизацией полученных фрагментов с определенными специфическими последовательностями на ДНК ее повторяемого элемента IS6110. Внутривидовая вариабельность реализуется за счет вариабельного числа повторов IS6110 и их расположения на ДНК, а также разнообразия расстояний между определенными точками атаки фермента рестриктазы (сайты рестрикции) и элементом IS6110. Получаемый после гибридизации на нитроцеллюлозной мембране специфический рисунок полос характеризует ДНК конкретного штамма МБТ. Эта технология является весьма сложной и трудоемкой.

Альтернативой может быть, основанный на ПЦР, метод вариабельного числа тандемных повторов (ВЧТП), обнаруживаемых в значительном числе локусов генома М. tuberculosis. Этот метод достаточно дискриминативный и менее трудоемкий.

- Читать далее "Лечение туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis)"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 6.12.2019