Культуральные методы исследования до сих пор остаются предпочтительными при диагностике микозов. В медицинских микологических лабораториях основной средой для выделения патогенных грибов различных систематических групп является среда Сабуро, жидкая и агаризованная. Для предотвращения роста бактерий в среду добавляют антибиотики — пенициллин и стрептомицин (по 50-100 Ед/мл), либо хлорамфеникол и гентамицин (0,05 г/л), а также циклогексимид (актидион: 0,5 г/л) для сдерживания роста быстрорастущих сапрофитных грибов при изоляции дерматофитов и агентов подкожных микозов.

а) Методы посева патологического материала. После предварительного исследования биосубстратов под микроскопом клинический материал засевают на питательные среды. Посев проводят в стерильном боксе стерильной пастеровской пипеткой, пинцетом, шприцем и т.д. с использованием пламени спиртовки или газовой горелки. При проведении количественных исследований разведенные биосубстраты (мокрота, промывные воды бронхов, гайморовых полостей, моча, кал и пр.) засевают на агар мерно в количестве 0,1 мл. Перед посевом проводят контрольный забор воздуха в боксе на стерильность, чашку инкубируют при 25-30°С.

При проведении исследований на диморфные грибы для выявления психрофильных возбудителей, не растущих при 37°С (Geotrichum candidum, Absidia coerulea), или термотолерантных, слабее растущих при 25-30°С (Rhizopus arrhizus), а также для дифференцированного выделения из патологического материала нескольких видов грибов при смешанных инфекциях, делают парные посевы, так как быстро растущие психрофильные виды при исследовании в одном температурном режиме (25-30°С) могут вытеснять более термотолерантные виды. Посевы проводят в двух емкостях.

1. Кератиновые ткани. В случаях поверхностных микозов используют две среды Сабуро: для выделения дерматофитов — агар Сабуро с циклогексимидом (0,5 г/л) для предотвращения роста сапрофитных грибов и агар Сабуро без циклогексимида, но с гентамицином или хлорамфениколом для выделения не дерматофитных плесневых и дрожжеподобных грибов. Посевы инкубируют в течение 2 недель при температуре 25-30°С.

Соскобы со слизистой полости рта, вагины, уретры засевают на среду Сабуро и инкубируют при 37(’С в течение 7 дней.

Соскобы с роговой оболочки глаз, слизистой носа, отделяемое наружного слухового прохода, поверхностных ран, язв после посева инкубируют на среде Сабуро при 25-30°С. Срок инкубации — 7-10 дней.

2. Кровь засевают в соотношении 1:3 или 1:10 в следующие среды: во флаконы для гемокультур, в бульон Сабуро (среда накопления) или в сердечно-мозговую двухфазную среду. Посевы выращивают в течение 10 дней при температуре 37°С.

При посеве крови в среду накопления (жидкая среда Сабуро) на второй, пятый и седьмой день делают контрольный высев осадка на чашки с агаром Сабуро, которые выдерживаю т в термостате 2-5 суток при температуре 25-30°С и 37°С.

Использование двухфазной среды значительно увеличивает процент выявления грибов и сокращает время инкубации. При посеве крови в двухфазную среду необходимо смачивать поверхность агара засеянным бульоном дважды в день в течение 2 дней и один раз в день — последующие 5 дней. Контрольные высевы не производятся.

3. Спинномозговая жидкость (ликвор). Осадок ликвора засевают на две чашки с агаром Сабуро по 0,1 мл, а остаток спинномозговой жидкости — в пробирки с жидкой средой Сабуро. Чашки инкубируют при 25-30°С и 37°С, жидкую среду — при 25-30"С. Срок инкубации — 10 дней. Посевы начинают просматривать со второго дня. Если на 5-й день рост не обнаружен, производят высев из жидкой питательной среды на чашки с агаром Сабуро. Повторный посев также инкубируют при двух температурах.

4. Жидкости тела. Мокроту, промывные воды бронхов, гайморовых полостей, мочу, сок простаты, желчь, дуоденальный сок, абдоминальную, синовиальную жидкости и др. после предварительной обработки засевают в количестве 0,1 мл на агар Сабуро и инкубируют при 25-30"С и 37°С в течение 7-10 дней.

5. Гной. Материал засевают на агар Сабуро и/или сердечно-мозговой агар, инкубируют при 25-30°С и 37°С в течение 7-10 дней, а в случаях мицетомы — до 4 недель.

6. Ткани. Небольшие фрагменты ткани растирают шпателем по поверхности агара Сабуро. Одновременно кусочки ткани помещают в жидкую среду Сабуро. Посевы инкубируют при 25-30°С и 37°С в течение 10-14 дней.

7. Фекалии. Фекалии разводят 1:10 (1,0 г фекалий и 9 мл физиологического раствора или стерильной воды), размешивают, отстаивают 10 мин для осаждения крупных частиц, затем надосадочную жидкость в количестве 0,1 мл засевают на агар Сабуро. Посев инкубируют при 25-30°С и 37°С в течение 7 дней.

б) Культивирование и интерпретация результатов. Засеянные чашки начинают просматривать на второй день после посева с целью обнаружения начала роста возбудителей и дифференциации их от сапрофитов окружающей среды, которые могут контаминировать посевы. Особенно это важно при исследовании биосубстратов на наличие мицелиальных грибов. При обнаружении плесневых колоний отмечают рост культуры в точке посева и отсутствие роста идентичных штаммов в контрольной чашке (проверка микробиологической чистоты воздушной среды в боксе). Рост грибов Candida и Aspergillus можно видеть уже на 2-3-й день. При наличии медленно растущих патогенов время инкубации продлевается с одновременным пересевом на селективные среды для идентификации и предотвращения зарастания культур сапрофитными контаминантами.

При мерном посеве патологического материала проводят количественный учет выросших колоний в колониеобразующих единицах на 1 мл исследуемого биосубстрата (КОЕ/мл) по формуле п=а*b*с, где а — среднее число колоний, b=10 при объеме посевного материала 0,1 мл, с — степень разведения материала (10, 100, 1000). При интерпретации результатов исследования на кандидоз учитывают количественные критерии содержания Candida в биосубстратах. Так, в норме у здорового человека грибы рода Candida могут присутствовать в смывах с гениталий, в содержимом желудка — до 10² КОЕ/мл, в мокроте, смывах с полости рта, в носоглоточной слизи — до 10³ КОЕ/мл, в кале — до 10⁴ КОЕ/мл. В стерильных жидкостях организма (крови, ликворе, содержимом желудочков мозга, желчи, синовиальной суставной жидкости, соке простаты, моче и т.д.) грибы должны отсутствовать. Бронхоальвеолярный лаваж от иммуносупрессированных пациентов расценивают как стерильный биосубстрат для всех возбудителей, кроме Candida.

При посевах отделяемого невскрывшихся абсцессов, биоптатов и пр. количественный учет грибов не проводят, диагностическое значение имеет наличие роста возбудителя. Выявление дерматомицетов при исследовании кожи, волос и ногтей почти всегда свидетельствует о наличии микоза. Клиническое значение выделения различных микромицетов из нестерильных в норме биосубстратов: с поверхности кожи, в соскобах со слизистых оболочек, язв и т. п. неодинаково. При оценке результатов анализа учитывают характер роста выявляемых культур (единичный, умеренный, значительный; рост в точках посева, идентичность возбудителя в парных посевах и т. п.), данные предварительного микроскопического исследования патологического материала, наличие характерных клинических проявлений и сопоставление с литературными данными других исследователей.

Помимо основной среды Сабуро, в современных микологических лабораториях широко используются хромогенные среды («CandiSelect 4»,«Candida ID 2 Agar» и пр.) для первичного выделения дрожжевых грибов, которые позволяют визуально выявлять смешанные культуры дрожжевых возбудителей и значительно облегчают идентификацию Candida spp. Наиболее распространенные виды Candida (С. albicans, С. kmsei, С. tropicalis, С. glabrata и др.) на хромогенных средах идентифицируют по специфическому для вида окрашиванию колоний.

В случае отсутствия в лаборатории хромогенных сред и идентификационных тест-систем для определения дрожжевых грибов используют сыворотку крови, картофельный или кукурузный агары (идентификация С. albicans), агар с дигидроксифенилаланином — для определения Cryptococcus neoformans и т.д.

Плесневые грибы при наличии спороношения можно идентифицировать на среде Сабуро. Но если позволяют время и возможности, грибы пересевают на селективные среды, на которых грибы образуют типичные для своего вида колонии, стимулирующие образование конидий или других характерных структур, важных для определения возбудителя. С целью идентификации видов аспергиллов, пенициллов и других плесневых возбудителей используют агар Чапека, картофельный, кукурузный и дугие агары. Для выявления дрожжевой фазы диморфных грибов применяется сердечно-мозговой агар. Кукурузный агар с сахарозой и дрожжевым экстрактом подходит для спорообразования у некоторых зигомицетов и т.д. Для выполнения посевов разработаны также коммерческие стандартные среды.

Идентификацию выделенных культур производят, прежде всего по морфологическим признакам колоний (по цвету, размеру, структуре, характеру поверхности, пигментации, наличию экссудата и пр.), по микроморфологии гриба (по наличию перегородок в мицелии, псевдомицелия, почкующихся клеток, артроспор, строению конидиеносцев, расположению и форме конидий и т.д.) и биохимическим особенностям (ферментативной и ассимиляционной активности). Микроморфологию гриба изучают в нативных препаратах с добавлением смеси равных объемов спирта, воды и глицерина.

в) Определение чувствительности выделенных культур грибов к антимикотическим препаратам. При диагностике микозов, вызванных дрожжевыми грибами, помимо видовой идентификации возбудителя нужно проводить определение чувствительности к антимикотикам. При невозможности таких исследований в лечении можно использовать имеющиеся в литературе сведения об устойчивости выделенного вида к определенным препаратам. Но часто этого недостаточно, так как даже хорошо изученная и описанная лекарственная чувствительность у ряда видов Candida значительно варьирует у разных штаммов этого вида. У внутрибольничных патогенов возможно развитие резистентности к постоянно применяемым в стационаре ранее эффективным антимикотикам, и простое определение вида возбудителя теряет клиническое значение без последующего проведения теста на чувствительность.

Для определениия чувствительности дрожжевых грибов к антимикотикам применяют стандартизованный метод микроразведений в среде RPMI 1640, используемой в коммерческих тест-системах (например, «Fungitest», Bio-Rad).

Выбор антимикотиков для лечения плесневых микозов представляет определенные трудности, так как стандартизированный метод серийных разведений для плесневых грибов еще не разработан в полном объеме. Можно проводить определение чувствительности диско-диффузионным методом. Но результаты, полученные in vitro, могут не соответствовать эффективности проведенной терапии. На данном этапе установлены минимальные подавляющие концентрации современных антимикотиков (амфотерицин В, флуконазол, итраконазол, кетоконазол, вориконазол) в отношении основных возбудителей плесневых микозов, с учетом которых проводят эмпирическую терапию, одновременно руководствуясь опубликованным опытом других клиницистов.

- Читать далее "Гистологический метод диагностики микозов (грибковой инфекции)"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 1.6.2020