Морфологические и культуральные свойства холерных вибрионов (V. cholerae)

а) Возбудители холеры. Нозологическая самостоятельность инфекционной болезни определяется видовой спецификой возбудителя. До 1962 г. возбудителем холеры считался классический (азиатский) холерный вибрион, открытый Р. Кохом в 1883 г.

В период седьмой пандемии представления об этиологии холеры претерпели изменения. Спустя 22 года после открытия Кохом возбудителя холеры от паломников, возвращавшихся из Мекки и умерших от дизентерии, F. Gotschlich выделил холерный вибрион, агглютинирующийся О-холерной сывороткой, но лизирующий, в отличие от классического холерного вибриона, эритроциты барана или козы. Он получил название холерного вибриона эльтор (по месту его обнаружения). Уже в 1961 г. именно этот вибрион обнаруживался более чем у 90% всех заболевших холерой в мире.

Учитывая возросшую в 1961 г. эпидемическую опасность диарей, обусловленных вибрионами эльтор, в августе 1962 г. ВОЗ вынесла резолюцию о признании вибрионов эльтор возбудителями холеры, которую назвали холерой эльтор, в отличие от классической (азиатской) холеры, обусловленной классическими холерными вибрионами.

Однако только в октябре 1962 г. при ликвидации вспышки холеры в Западном Ириане (Новая Гвинея) стало ясно, что возбудителем холеры эльтор является холерный вибрион эльтор негемолитического варианта (Н1у-), а гемолитический вариант (Hly+) вибрионов эльтор, открытый F. Gotschlich в 1905 г., способен вызывать острые диареи неэпидемического и, тем более, непандемического характера.

Изучение негемолитических вариантов холерных вибрионов, классических и эльтор, на генетическом уровне показало, что в их геномах присутствует ген токсинообразования (ctx), экспрессия которого в организме человека и приводит к заболеванию холерой, способной к эпидемическому и даже к пандемическому распространению.

Гемолитический же вариант холерных вибрионов эльтор не содержит в своем геноме гена токсинообразования (ctx-) и вызывает лишь спорадические или групповые случаи холеры, связанные с единым источником заражения.

В октябре 1992 г. на побережье Бенгальского залива зарегистрирована эпидемическая вспышка диарейных заболеваний, обусловленных вибрионами, филогенетически и генетически близкими к холерным вибрионам эльтор негемолитического варианта, но принадлежащих не к O1, а к O139 серологической группе. Этот возбудитель, признанный ВОЗ вариантом холерных вибрионов с пандемическим потенциалом, обозначен как Vibrio cholerae O139 «Бенгал», а холера, обусловленная данными микроорганизмами, — как холера «Бенгал». Как и в случае с холерными вибрионами эльтор, Vibrio cholerae 0139 «Бенгал» имеет гемолитический вариант (Н1у+), вызывающий диареи неэпидемического характера.

В свете выше изложенного этиологическая структура холеры на современном этапе представляется следующим образом:

- Vibrio cholerae O1 biotype cholerae (серотипы Ogava, Inaba, Hikojima) - вызывает классическую (азиатскую) холеру;

- Vibrio cholerae O1 biotype eltor (серотипы Ogava, Inaba, Hikojima) (Hly-, ctx+) — вызывает эпидемическую холеру эльтор;

- Vibrio cholerae O1 biotype eltor (серотипы Ogava, Inaba, Hikojima) (Hly+, ctx-) — вызывает неэпидемическую холеру эльтор;

- Vibrio cholerae O139 «Бенгал» (Hly-, ctx+) — вызывает эпидемическую холеру «Бенгал»;

- Vibrio cholerae O139 «Бенгал» (Hly+, ctx-) — вызывает неэпидемическую холеру «Бенгал».

В Международной классификации болезней 10-го пересмотра (МКБ-10, Женева, 1992) холера, включенная в группу кишечных инфекций, представлена в следующих рубриках;

АОО.0 — холера, обусловленная Vibrio cholerae O1 biotype cholerae (классическая холера);

AOO.1 — холера, обусловленная Vibrio cholerae O1 biotype eltor (холера эльтор);

AOO.9 — холера не уточненная.

Представленная выше этиологическая структура современной холеры не противоречит данному документу ВОЗ, а уточняет качественное содержание рубрики АОО.1 и дополняет его новой рубрикой — холера, обусловленная Vibrio cholerae 0139 «Бенгал», которая может быть введена МКБ при следующем ее пересмотре.

Морфологические и культуральные свойства холерных вибрионов  (V. cholerae)

б) Морфологические и культуральные свойства холерных вибрионов. По морфологии холерные вибрионы классические, эльтор и 0139 «Бенгал» не отличаются друг от друга. Они представляют собой небольшие слегка изогнутые или прямые палочки, значительно варьирующие в размерах: их длина колеблется от 1,5 до 3 мкм, ширина — 0,2-0,6 мкм.

Холерный вибрион не образует спор, имеет один полярно расположенный жгутик в 2-3 раза длиннее тела клетки. Такое расположение жгутика дает возможность холерному вибриону активно двигаться.

Что касается капсулообразования, то в настоящее время считают, что холерные вибрионы серологической группы не O1 образуют небольшую полисахаридную капсулу, хотя этот признак выявляется далеко не у всех клеток, т.е. холерные вибрионы серогруппы не O1 могут находиться как в инкапсулированном, так и в неинкапсулированном состоянии. Это же относится и к V. cholerae 0139, являющемуся возбудителем холеры.

Холерные вибрионы хорошо воспринимают окраску анилиновыми красителями, по Граму окрашиваются отрицательно. В мазках, окрашенных анилиновыми красками, клетки холерных вибрионов располагаются поодиночке, напоминая запятую, или последовательно попарно в виде буквы S. Иногда встречаются короткие цепочки, состоящие из изогнутых палочек.

Холерный вибрион отличается выраженным полиморфизмом: в одном и том же окрашенном препарате можно видеть палочки, отличающиеся друг от друга по размеру и степени изогнутости. Характерна микроскопическая картина препаратов из содержимого кишечника больных холерой: клетки вибрионов располагаются рядами параллельно друг другу, наподобие стаек рыб. Такая картина наблюдается при простой окраске, например, фуксином в течение 2-3 мин.

Электронно-микроскопическое изучение вибрионов показало, что их клеточная стенка состоит из трех компонентов: полисахаридов, липидов и белков. Прилегающая к ней изнутри цитоплазматическая мембрана также имеет трехслойное строение. Она играет важную роль в жизнедеятельности клетки: в ней происходит синтез клеточной стенки, синтезируются ферменты, активно идут окислительные процессы. Внутри клетки располагается цитоплазма с диффузным ядерным веществом, содержатся ДНК, РНК, митохондрии, различные включения. Жгутик имеет довольно сложное строение. Он начинается от базальной гранулы вблизи цитоплазматической мембраны.

Снаружи жгутик покрыт чехлом, состоящим из полисахаридов, и потому имеет антигенное строение, сходное с клеточной стенкой. Наличие такого «футляра» у жгутиков объясняет феномен их свечения после обработки клеток холерными люминесцирующими сыворотками.

При фазово-контрастной микроскопии препарата раздавленной капли можно отчетливо наблюдать слегка изогнутые палочки с единственным жгутиком на конце. При этом видна характерная для вибрионов подвижность — клетки мгновенно пересекают поле зрения, иногда сталкиваясь друг с другом; если вибрионов в поле зрения много, то их движения напоминают роение мух.

Холерные вибрионы — факультативные анаэробы с более выраженными аэробными свойствами. Неприхотливы. Хорошо растут на простых питательных средах, таких как мясопептонный агар, агар Мартена, агар Хоттингера и др. Температурная граница роста 10-40°С, оптимальные условия культивирования 30-37°С, pH 7,6-8,2. Растут также при pH 9,0-9,2. Жидкими питательными накопительными средами являются 1%-ная пептонная вода, мясопептонный и другие бульоны. На поверхности 1%-ной пептонной воды рост холерного вибриона проявляется через 6-8 ч в виде нежной пленки. На щелочном агаре холерные вибрионы через 12-14 ч образуют колонии диаметром 1-2 мм. На элективно-дифференциальных средах темпы формирования колоний замедлены — до 18-20 ч.

На пластинках щелочного агара холерные вибрионы классические и эльтор образуют типичные гладкие плоские круглые прозрачные с голубоватым оттенком колонии. Поверхность колоний влажная блестящая, край ровный или слегка волнистый.

Холерные вибрионы серогруппы O139 образуют два типа колоний: инкапсулированные непрозрачные, мутные, средних размеров и неинкапсулированные прозрачные более мелкие колонии. Другими словами, морфология колоний холерных вибрионов серогруппы O139 сходна с морфологией колоний холерных вибрионов серогруппы не O1, которые могут находиться как в инкапсулированной форме с непрозрачной морфологией колоний, так и в неинкапсулированной или минимально инкапсулированной с полупрозрачной морфологией колоний.

Холерные вибрионы серогруппы O1, так же как и других серогрупп, при неблагоприятных для их развития условиях окружающей среды могут переходить в медленно растущие на питательных средах L-формы или в так называемое некультивируемое состояние (НС). Для обозначения форм вибрионов, не способных образовывать колонии на питательных средах, введен термин «некультивируемые формы» (НФ).

Феномен некультивируемости микроорганизмов стал известен широкому кругу микробиологов в 80-х гг. XX в. благодаря работам R.R. Colwell и др., хотя ранее термин «некультивируемость» был предложен ЕС. Warring (1970) и R. Parrot с соавт. (1971) для туберкулезных палочек, которые переставали образовывать колонии на плотных средах, но оставались живыми.

Для выявления НФ холерных вибрионов, применяют различные методы, которые можно разделить на три группы:

- прямой подсчет клеток с применением различных красителей, например акридинового оранжевого, при помощи которого можно дифференцировать живые (флюоресцируют красным светом) и инактивированные (флюоресцируют зеленым светом) клетки;

- методы, основанные на регистрации процессов жизнедеятельности (например, метод восстановления солей тетразоля );

- молекулярно-генетические методы, например ПЦР, в основе которой лежит реплицирование специфической последовательности ДНК или РНК, катализируемое полимеразой, в результате чего концентрация специфической олигонуклеотидной последовательности в пробе возрастает до 106 раз.

В некультивируемом состоянии клетки вибрионов претерпевают следующие изменения: они уменьшаются в размере и превращаются в маленькие сферические клетки. При фазово-контрастной микроскопии препарата раздавленной капли, приготовленного из автоклавированной воды, содержащей холерные вибрионы, находящиеся в НС, наблюдается следующая картина: на фоне серовато-белых шаровидных неподвижных образований видны единичные клетки, сохранившие палочковидную форму. Часть этих палочек окружена слизистой капсулой, размеры которой во много раз превосходят размеры самой микробной клетки. Такая же морфология клеток вибрионов наблюдается и при электронно-микроскопическом исследовании НФ холерного вибриона.

Установлено также, что пока в препаратах раздавленной капли при фазово-контрастной микроскопии наблюдаются палочковидные формы (инкапсулированные или не инкапсулированные), возможна реверсия этих клеток в исходные формы.

Морфологические и культуральные свойства холерных вибрионов  (V. cholerae)

в) Биохимические свойства холерных вибрионов. Возбудители холеры, а их на сегодня известно три (Vibrio cholerae O1 biotype cholerae, V. cholerae O1 biotype eltor, V. cholerae 0139 «Бенгал»), обладают большим набором ферментов. Они образуют индофенолоксидазу, декарбоксилируют лизин и орнитин, расщепляют глюкозу в аэробных и анаэробных условиях с образованием кислоты без газа, ферментируют маннит, сахарозу, маннозу, мальтозу, левулезу, галактозу, разлагают крахмал и декстрин.

Лактозу не разлагают, по крайней мере, в первые сутки. Арабинозу, дульцит, рафинозу, рамнозу, инозит, салицин и сорбит холерные вибрионы не расщепляют.

Предложенное в 1934 г. Хейбергом, а в 1965 — Смитом и Гудиером разделение вибрионов на восемь биохимических групп позволяет определить принадлежность V. cholerae к I (манноза +, сахароза +, арабиноза -) и II (манноза -, сахароза +, арабиноза -) группам. Остальные биохимические группы представлены другими видами вибрионов (V. mimicus, V. metschnikovii, V. fluvialis и др.). При росте в глюкозофосфатном бульоне Кларка при 20-37°С вибрионы биовара эльтор и V. cholerae O139, как правило, образуют ацетилметилкарбинол (реакция ФогесПроскауэра +), а классические холерные вибрионы такой способностью не обладают (реакция Фогес-Проскауэра — ).

Для холерных вибрионов характерна выраженная протеолитическая активность: они разжижают желатину, казеин, фибрин и другие белки. Кроме протеаз вибрионы вырабатывают и другие экзоферменты: лецитиназу, липазу, РНКазу, муциназу, нейраминидазу, аденилатциклазу.

При росте в 1%-ной пептонной воде или бульоне холерные вибрионы разлагают имеющийся в них триптофан с образованием индола. Кроме того, они редуцируют нитраты в нитриты. Совокупность этих двух признаков улавливается при помощи нитрозоиндоловой или cholera-rot реакции.

Холерные вибрионы обладают способностью лизировать эритроциты различных животных. Сформулирована гипотеза о полифункциональном механизме этого процесса, в котором принимает участие целый ряд ферментов. Известно, что в пробе Грейга эритроциты лизируются холерными вибрионами, лишенными гена холерного токсина, т.е. нетоксигенными. В связи с этим гемолитический тест (проба Грейга), который использовался для дифференциации классического холерного вибриона от вибрионов эльтор в период седьмой пандемии, предложен для дифференциации токсигенных и нетоксигенных штаммов О1 и O139 серогрупп.

г) Иммунитет. Повторные заболевания холерой не описаны. В эндемичных очагах холеры, как правило, болеют дети, старики и лица с нарушениями функции пищеварительной системы (с гипо- и анацидными гастритами и т.д.). Специфическая же профилактика всеми известными вакцинами защищает в течение 3-6 мес. около 60% привитых. Показатели гуморатьного иммунитета — антимикробные и антитоксические антитела обнаруживают у переболевших и привитых, начиная с 3-9-го дня, в течение 2-3 мес. с пиком на 20-25-й день.

- Читать далее "Антигены и факторы патогенности холерного вибриона (V. cholerae)"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 9.1.2020

Остались вопросы или замечания?

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.