Для качественного выявления специфических Ат чаще всего используют тест-системы, разработанные на основе непрямого ИФА. Принцип непрямого ИФА заключается в том, что ИК, образовавшиеся на иммуносорбенте, специфически выявляются конъюгатом, в состав которого входят моноклональные Ат против иммуноглобулинов человека, меченные ферментом. Дальнейшее проведение реакции энзим-субстрат позволяет визуализировать положительный результат.

а) Схема проведения непрямого твердофазного ИФА. Проведение непрямого твердофазного ИФА включает IV этапа.

Этап I. Проведение реакции антиген-антитело, которая происходит в ходе инкубации сыворотки на иммуносорбенте, с образованием на твердой фазе специфических ИК. После завершения этапа необходимо тщательно отмыть иммуносорбент от неспецифически связавшихся иммуноглобулинов сыворотки.

Этап II. Специфическое мечение ИК ферментной меткой в ходе инкубации с конъюгатом. После завершения этапа необходимо тщательно отмыть иммуносорбент от неспецифически связавшихся молекул конъюгата.

Этап III. Проявление специфических ИК в реакции энзим-субстрат после инкубации с субстратной смесью

Этап IV. Остановка реакции энзим-субстрат после добавления стоп-реагента. Учет результатов.

б) Оборудование, используемое при работе с тест-системами ИФА. Иммуноферментная лаборатория должна быть оснащена основным оборудованием для проведения всех этапов ИФА: автоматическими одноканальными и многоканальными микродозаторами с переменным объемом, термостатом-встряхивателем для инкубации реакционной смеси в 96-луночных плоскодонных планшетах или пластиковых камерах, автоматическим промывателем планшетов и вертикальным фотометром с набором светофильтров.

в) Конструирование тест-систем непрямого ИФА:

1. Иммуносорбент. В качестве иммуносорбентов обычно используют пластиковые 96-луночные плоскодонные планшеты, карточки, нитроцеллюлозные мембраны, на которые предварительно нанесены Аг. От того, насколько специфичны и хорошо очищены адсорбированные Аг, присутствуют ли они в достаточно высокой локальной концентрации, зависит качество исследования и достоверность полученных результатов.

Наличие неспецифических примесей может приводить к получению ложноположительных результатов, а отсутствие каких-либо Аг является основной причиной ложноотрицательных результатов. Поэтому при разработке тест-систем ИФА стараются нанести на твердую фазу все антигены, на которые в ходе заболевания вырабатываются Ат.

По способу получения нанесенных Аг тест-системы условно делятся на несколько поколений. В тест-системах первого поколения на твердую фазу наносят лизат микробных клеток. В настоящее время их практически не применяют из-за высокого содержания неспецифических примесей и дороговизны получения.

В основном используют тест-системы второго поколения, где в качестве антигенов используют рекомбинантные белки, полученные генно-инженерным способом. Широкое распространение получили тест-системы третьего поколения, в которых отдельные антигенные детерминанты микробов представлены синтетическими пептидами.

Тест-системы четвертого поколения характеризуются наличием на твердой фазе смеси, состоящей из антигенов и антител. Они предназначены для одновременного выявления циркулирующих в крови Ат и Аг. Например, такие тест-системы используются для ранней иммунодиагностики ВИЧ-инфекции.

В зависимости от целей проведения анализов выпускают тест-системы ИФА для массовых скрининговых и единичных исследований. В тест-системах для скрининга в качестве иммуносорбента чаще всего используют 96-луночные плоскодонные планшеты, покрытые смесью Аг. Их применение в хорошо оснащенных ИФА-оборудованием лабораториях позволяет выполнять большой объем анализов в полуавтоматическом или полностью автоматизированном режимах. В настоящее время в одной лаборатории удается удачно сочетать массовые исследования с единичными. При этом используют «бесприборные» тест-системы ИФА, в которых смесь Аг нанесена на специальные карточки. Учет результатов в них может осуществляться визуально.

В случае выявления ИФА-положительных сывороток, их необходимо «подтвердить», то есть исследовать в более чувствительных тест-системах, одной из важных характеристик которых является раздельное нанесение на твердую фазу специфичных белков, определяющих патогенность вирулентных штаммов микробов.

2. Конъюгат, его значение при разработке тест-систем ИФА. Чувствительность ИФА-исследования зависит от выявления ИК, которое осуществляется при помощи специфических конъюгатов. Конъюгат представляет собой химическое соединение носителя и фермента, чаще всего пероксидазы хрена.

В качестве носителей применяют поликлональные или получаемые путем ги-бридомной технологии, моноклональные антитела, которые специфично доставляют фермент к И К. Хорошо известно, что на разных стадиях инфекционного процесса происходит переключение синтеза иммуноглобулинов. В зависимости от того, для каких целей предназначена та или иная диагностическая система, в ней используются конъюгаты, включающие меченные ферментом антитела против различных классов иммуноглобулинов — IgM, IgG, IgA, IgE. Для иммунодиагностики и иммуномониторинга инфекционного заболевания принято комплексное использование различных тест-систем ИФА как для определения суммарных (IgM+IgG+IgA) Ат, так и отдельных IgM, IgG и IgA — специфических Ат.

Каждая из перечисленных тест-систем отличается по специфичности конъюгатов. Для определения суммарных Ат используется конъюгат с поликлональными антителами-носителями. В тест-системах, разработанных для выявления Ат, принадлежащих к иммуноглобулинам какого-либо одного класса, конъюгат представлен специфическими моноклональными антителами, меченными ферментом. Например, при иммунодиагностике сифилиса сначала проводят исследование в тест-системе ИФА, предназначенной для определения суммарных Ат к Tr.pallidum. В случае положительного результата приступают к исследованию той же сыворотки в двух других тест-системах, разработанных для выявления как специфических IgM, так и IgG антител к антигенам Tr.pallidum.

Чувствительность исследования специфических Ат можно многократно повысить путем использования биотин-авидиновой системы конъюгатов, обеспечивающих создание «усиленного» ИФА. Как видно из рисунка 20.3, для выявления образовавшихся ИК последовательно используют 2 конъюгата. Сначала применяют конъюгат № 1, представленный антителами к иммуноглобулинам человека, меченными биотином, после инкубации с которым происходит мечение ИК биотином. В дальнейшем, после инкубации с конъюгатом № 2 происходит образование комплекса авидин-биотин, в котором на одну молекулу биотина приходится до пяти молекул меченного ферментом авидина. Концентрация фермента вокруг ИК возрастает во много раз, что приводит к значительному увеличению сигнала в реакции энзим-субстрат.

3. Реакция энзим-субстрат. Для иммунодиагностики инфекционных заболеваний наиболее широко применяются тест-системы ИФА, в которых конечным продуктом реакции энзим-субстрат-индикатор является окрашенное вещество. Схема реакции приведена на рисунке ниже. Субстратом для пероксидазы является перекись водорода, а в качестве индикаторов используются вещества-хромогены, которые в ходе окислительно-восстановительной реакции приобретают окраску. К ним, например, относятся ОФД (орто-фенилен-диамин, длина волны поглощения 492 нм), ТМБ (тетраметилбензидин, длина волны поглощения 450 нм) и др.

Как видно из схемы, реакция протекает в две стадии: на первой — под действием пероксидазы, связанной с ИК, происходит разложение перекиси водорода на воду и атомарный кислоод; на второй — кислород окисляет хро-моген/индикатор с образованием окрашенного продукта. После проведения окислительно-восстановительной реакции при заданных в инструкции параметрах времени и температуры ее быстро останавливают стоп-реагентом.

Учет результатов осуществляют по оптической плотности раствора в лунках планшета при помощи программируемого вертикального фотометра. Длина волны поглощения определяется окраской хромогена и задается в инструкции. Колориметрический учет ИФА является наиболее распространенным, используется в тест-системах ИФА различного производства.

Чувствительность ИФА можно дополнительно повысить в ходе проявления реакции энзим-субстрат, применяя индикаторы с люминесцентными и хемилюминесцентными свойствами. При этом учет реакции будет проводиться на флуориметрах или хемолюминометрах, специально запрограммированных для тест-систем конкретных фирм.

Таким образом, чувствительность тест-систем ИФА напрямую зависит от свойств иммуносорбента, конъюгата и индикаторов конечной реакции энзим-субстрат.

- Читать далее "Тест-системы ИФА для выявления различных классов специфических Ат с использованием 96-луночных плоскодонных планшетов в качестве иммуносорбентов"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 31.08.2019