Использование наборов для ИФА с 96-луночными плоскодонными планшетами широко распространено в нашей стране и за рубежом, так как позволяет одновременно оценивать большое число сывороток — порядка нескольких сотен в день.

В настоящее время существует большой постоянно пополняющийся перечень тест-систем ИФА для иммунодиагностики бактериальных инфекций. В этих тест-системах на дне и стенках лунок планшета адсорбирована смесь антигенов микроба. В зависимости от специфичности используемых конъюгатов проводят определение различных классов специфических Ат в сыворотке крови, а также в другом биологическом материале.

а) Набор реагентов:
• Инструкция.
• Диагностические сенсибилизированные Аг, 96-луночные плоскодонные планшеты (иммуносорбенты) для определения специфических Ат.
• Положительная контрольная сыворотка (К+), содержащая специфические Ат в высоком титре.
• Слабоположительная контрольная сыворотка (не во всех тест-системах); отрицательная контрольная сыворотка (К-), не содержащая специфических Ат.
• Концентрат или готовый раствор конъюгата (моноклональные Ат против Ig человека, меченные ферментом пероксидазой).
• Концентрат отмывающего буфера (буфер № 1).
• Концентрат или готовый раствор разводящего буфера (буфер № 2).
• Концентрат или готовый раствор субстратного буфера.
• Субстрат (Н₂O₂) для фермента (может уже содержаться в субстратном буфере).
• Индикатор.
• Стоп-реагент.

Тест-систему ИФА, а также исследуемые сыворотки необходимо достать из холодильника за 30 мин до исследования, чтобы температура всех реагентов достигла комнатной температуры.

б) Подготовка к проведению исследования. Необходимо внимательно ознакомиться с инструкцией и составить протокол исследования с учетом количества контрольных и исследуемых сывороток.

Приготовить рабочие растворы отмывающего и разводящего буферов из концентратов № 1 и № 2, в соответствии с инструкцией. Отмывающий буфер используется для промывания лунок планшетов после каждого этапа исследования, за исключением этапа проявления реакции. При этом происходит удаление неспецифических иммунных комплексов. В качестве отмывающего буфера довольно часто используется фосфатно-солевой буфер (ФСБ) с pH 7,2-7,4, с 0,05% Twin 20/80.

Разводящий буфер предназначен для разведения образцов тестируемых и контрольных сывороток, а также для приготовления рабочего разведения конъюгата из концентрата. Разводящий буфер приготавливается на основе отмывающего буфера с добавлением 1% альбумина. Его часто называют блокирующим, так как альбумин, адсорбируясь па «пустотах» иммуносорбента, не заполненных Аг, препятствует неспецифическому связыванию сывороточных иммуноглобулинов.

Подготовить образцы тестируемых и контрольных К+ и К- сывороток, если требуется развести.

в) Проведение исследования:

Этап 1. Образование специфических ИК в результате реакции антиген-антитело. В лунки диагностического планшета, в соответствии с протоколом исследования, вносят автоматическим микродозатором с индивидуальными одноразовыми сменными наконечниками подготовленные образцы К+, К- и тестируемых сывороток в указанном в инструкции объеме. В лунки для контроля конъюгата (КК) и контроля субстрата (КС) добавляют только разводящий буфер.

Планшет накрывают крышкой или заклеивают скотчем и помещают в термостат. Температура и время инкубации индивидуальны для каждой тест-системы и всегда указаны в инструкции. После окончания инкубации планшет достают из термостата и все лунки, заполненные тестируемыми и контрольными сыворотками, включая КК и КС, тщательно несколько раз (в соответствии с инструкцией) отмывают буфером № 1 с использованием автоматического промывателя для планшетов.

В ходе этой процедуры объем отмывающего буфера в 2-3 раза превышает объем добавленных сывороток. Каждое отмывание сопровождается тщательным удалением буфера — лунки должны быть сухими. В ходе отмывания удаляются все неспецифически образовавшиеся на твердой фазе И К. После отмывания в К- и в лунках с отрицательными тестируемыми сыворотками на твердой фазе остается только Аг, как и до начала реакции. В то же время в лунках с К+ и с положительными тестируемыми сыворотками образовавшиеся специфические ИК прочно фиксированы на твердой фазе.

Этап 2. Мечение ИК ферментной меткой с использованием конъюгата. Для выполнения данного этапа во все отмытые лунки вносят рабочий раствор конъюгата в том же объеме, что и сыворотки на первом этапе. Планшет накрывают чистой крышкой или заклеивают новым скотчем и инкубируют в соответствии с инструкцией. После инкубации лунки планшета отмывают так же, как после первого этапа, в результате чего из них удаляются все неспецифически связавшиеся молекулы конъюгата.

После проведения второго этапа фермент-меченые ИК остаются только в лунках сК+ис положительными тестируемыми сыворотками.

Этап 3. Проявление ИК в реакции энзим-субстрат. Для проведения данного этапа ex temporo по инструкции готовят субстратную смесь, которая состоит из трех компонентов: субстратного буфера, который создает слабокислую среду для лучшего протекания реакции энзим-субстрат; перекиси водорода и индикатора. Субстратную смесь добавляют в рабочем объеме по инструкции, во все лунки планшета. После инкубации, которая проводится в темноте, при заданной температуре строго определенное время, начинают проявляться И К, и субстратная смесь в лунках с К+ и положительными тестируемыми сыворотками окрашивается.

В лунках с К- и отрицательными тестируемыми сыворотками окраска отсутствует.

Этап 4. Остановка реакции энзим-субстрат и учет результатов. Остановка реакции энзим-субстрат заключается в прерывании окислительновосстановительной реакции стоп-реагентом, в качестве которого используют растворы кислот или щелочей. Стоп-реагент быстро автоматической многоканальной пипеткой, добавляют во все лунки планшета, чем добиваются ее одновременной остановки во всех лунках. Учет результатов осуществляют с использованием вертикального фотометра при заданной длине волны.

- Читать далее "Тест-системы ИФА для качественного и количественного выявления различных классов специфических Ат с карточками-гребешками в виде иммуносорбентов"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 31.08.2019