После проведения первичного исследования сывороток на наличие специфических Ат методом ИФА возникает вопрос, насколько истинны получаемые результаты.

Известно, что в ходе иммунодиагностического исследования могут быть получены как ложноположительные, так и ложноотрицательные результаты. Причиной ложноположительных результатов в ИФА может быть наличие в сыворотке обследуемого пациента неспецифических перекрестно реагирующих Ат, появляющихся вследствие различных хронических заболевании, включая инфекционные, онкологические, аутоиммунные.

При иммунодиагностическом исследовании сывороток беременных женщин на наличие инфекций могут также быть получены ложноположительные результаты, что объясняют иммунологическими изменениями, сопровождающими это состояние.

Причиной ложноотрицательных результатов в ИФА является исследование сывороток в серонегативный период, когда соответствующие антитела еще не появились. Ат могут исчезать и не выявляться на фоне иммунодефицитного состояния из-за нарушения их продукции. Так, была описана негативация специфических антитрепонемных Ат у больных сифилисом на терминальной стадии ВИЧ-инфекции.

Ложноположительные и ложноотрицательные результаты могут быть следствием лабораторных ошибок. Это может быть связано с нарушением хранения сывороток, использованием для анализа гемолизированных и хилезных сывороток. Неправильное приготовление реагент тест-системы ИФА, плохое промывание иммуносорбента, нарушения режима инкубации — все это отрицательно влияет на качество исследований. Поэтому в протоколе проведения ИФА, согласно инструкции, предусмотрен соответствующий контроль.

Положительный (К+) и отрицательный (К-) — основные виды контроля чувствительности и специфичности работы тест-системы ИФА. К+ и К- представлены положительной (в современных системах имеется и слабоположительная) и отрицательной сыворотками, которые всегда входят в диагностический набор.

Контроль конъюгата (КК) используется для подтверждения специфичности взаимодействия конъюгата с ИК, а не с другими компонентами твердой фазы.

Контроль субстрата (КС) требуется для установки «О» на фотометре. В дальнейшем при измерении результатов в иммунодиагностических планшетах оптическая плотность (ОП) фоновой окраски субстратной смеси будет вычитаться из ОП субстратной смеси в лунках с К+, К-, КК и с тестируемыми сыворотками.

После регистрации результатов реакции в единицах ОП переходят к их мануальному или автоматическому учету. Способ учета всегда описывается в прилагаемой инструкции. Он складывается из двух этапов:
1) оценки чувствительности и специфичности работы тест-системы ИФА;
2) выявления ИФА-положительных сывороток.

Первый этап - оценку чувствительности и специфичности работы тест-системы ИФА осуществляют по К+, К-, КК, КС. Обычно эти параметры в единицах ОП задаются в инструкции. О плохом качестве тест-системы ИФА или о лабораторных ошибках, допущенных при выполнении исследования, могут свидетельствовать низкая величина ОП высокоположительной и/или слабоположительной сыворотки — К+, завышенные значения ОП в К- и/или в КК. Только при соответствии всех контрольных значений, полученных в ходе исследования, заданным можно приступать ко второму этапу-учету результатов и выявлению ИФА-положительных сывороток. Для этого по формуле в инструкции с использованием полученных значений ОП К- или ОП КК либо ОП К+ рассчитывают критическую величину ОП. Сыворотку считают ИФА+, если ОП в соответствующей лунке превышает рассчитанную критическую величину ОП.

Достоверность выявляемых положительных результатов зависит от чувствительности и специфичности используемой тест-системы ИФА. Эти параметры рассчитываются сразу же после ее разработки на производстве и всегда указываются в паспорте, прилагаемом к каждому диагностическому набору.

Для определения чувствительности и специфичности используют панели документально подтвержденных положительных и отрицательных сывороток. Чувствительность тест-системы ИФА оценивается по проценту выявления положительных сывороток, а специфичность — по проценту выявления отрицательных сывороток. Если, к примеру, из 100 положительных сывороток в данной тест-системе определяется 97, как ИФА-положительные (ИФА+) и 3 — ИФА-отрицательные (ИФА-), то ее чувствительность составляет 97%. В то же время, если из 100 стандартных отрицательных сывороток в ней выявляются 15 как ложноположительные, то специфичность ее составляет лишь 85%. Таким образом, процент получения истинно положительного результата зависит от чувствительности и специфичности тест-системы и определяется величиной показателя прогностического значения (ППЗ) положительного результата.

Показано, что большинство тест-систем ИФА при высокой чувствительности характеризуется более низкими показателями специфичности, что указывает на необходимость дальнейшего подтверждения ИФА+результатов, т. е. проведения дополнительного исследования ИФА+ положительных сывороток.

Для этих целей используют более чувствительные тест-системы — «Вестерн-блот», либо комбинируют ИФА с неиммуноферментными тестами, в основе которых лежат реакции связывания комплемента, агглютинации, пассивной гемагглютинации, люминесценции. Получение положительного результата в 2-3 иммунодиагностических тестах с различным механизмом действия также указывает на достоверность полученного результата. Например, при обследовании на ВИЧ-инфекцию в случае ИФА+ результата, полученного при скрининговом исследовании, сыворотку обязаны перепроверить с использованием более чувствительного метода ИФА — «Вестернблот» (наборы «Иммуноблот»), Примером комбинации ИФА с другими тестами может быть иммунодиагностика сифилиса. Так, в соответствии с приказом МЗ РФ № 87 (от 26.03.01), для серологической диагностики сифилиса при обследовании доноров крови необходимо применять ИФА (несколько тест-систем для выявления различных классов специфических антитрепонемных Ат) в сочетании с микрореакцией преципитации с кардиолипиновым Аг.

- Читать далее "Подтверждающий анализ «Вестернблот»: тест система, проведение"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 31.08.2019