Подтверждающий анализ «Вестернблот»: тест система, проведение

«Вестернблот» представляет собой непрямой ИФА, выполняемый на нитроцеллюлозных мембранах (НМ). Более высокая чувствительность и специфичность данного исследования, по сравнению с описанными выше, связана с особенностями иммуносорбента, которые позволяют выявлять Ат не к смеси Аг, нанесенных на твердую фазу, как в 96-луночном планшетном варианте ИФА или в тест-системах «ИммуноКомб II», а к отдельным индивидуальным высокоспецифичным Аг, в том числе характеризующим патогенные штаммы.

Подготовка НМ в качестве иммуносорбента при разработке наборов «Вестернблот» проводится следующим образом. Микробные антигены получают либо из клеточного лизата микробной культуры, либо генно-инженерными методами и фракционируют в ступенчатом градиенте концентраций полиакриламидного геля (ПААГ) методом электрофореза. При этом происходит разделение белковых молекул Аг в зависимости от их заряда и молекулярной массы. После завершения электрофоретического фракционирования ПААГ накрывают НМ и методом электроэлюции переносят на нее фракционированные белки (блот-отпечаток).

Затем НМ с «отпечатанными» белками микроба нарезают на узкие полоски, которые используются в тест-системах «Вестернблот», в качестве иммуносорбентов. Главным преимуществом НМ-иммуносорбентов является, во-первых, то, что Аг, находящиеся на твердой фазе, хорошо разделены между собой (представлены в виде узких полос) и находятся в высокой локальной концентрации. Во-вторых, НМ лучше фиксируют специфические иммунные комплексы за счет большей эффективности связывания белков. Использование биотин-стрептавидиновой системы конъюгатов также приводит к существенному повышению чувствительности такого анализа.

а) Тест-системы «Вестернблот» для определения специфических Ат против отдельных микробных Аг. Впервые в качестве подтверждающего анализа тест-системы «Вестернблот» («Иммуноблот») были применены для иммунодиагностики ВИЧ-инфекции. В настоящее время за рубежом разработаны различные тест-системы «Вестернблот» для иммунодиагностики бактериальных инфекций.

1. Набор реагентов:
• Инструкция.
• Иммуносорбенты (НМ с антигенами).
• Положительная (К+) и отрицательная (К-) контрольные сыворотки.
• Концентрат конъюгата.
• Буфер для разведения сывороток.
• Буфер для приготовления рабочего разведения конъюгата.
• Блокирующий буфер для отмывания НМ.
• Буфер для приготовления субстратной смеси.
• Субстрат — перекись водорода.
• Индикатор (хромоген)-3,3-диаминобензидин (ДАБ).
• Стоп-реагент.
• Камера пластмассовая для проведения исследования.
• Липкая пленка для заклеивания камеры.

2. Подготовка к проведению исследования. Тест-систему и исследуемые сыворотки достают из холодильника за 30 мин до проведения исследования, чтобы температура всех реагентов и сывороток достигла 20-22°С.

Внимательно изучают инструкцию и составляют протокол исследования с учетом количества контрольных и исследуемых сывороток.

Готовят рабочее разведение буфера для разведения сывороток.

Приготавливают рабочее разведение блокирующего буфера для отмывания НМ.

Достают из тест-системы необходимое количество НМ с учетом количества тестируемых сывороток, К+ и К-.

Тест-система «Вестернблот»
Тест-система «Вестернблот»:
I — приготовление иммуносорбента: 1 — культура микробов; 2 — лизат микробных клеток; 3 — рекомбинантные белки; 4 — «разогнанные» белки после ЭФ в ПААГ; 5 — перенесенные белки на НМ; 6 — нарезание НМ на узкие полоски.
II — схема проведения исследования методом «Вестернблот»: 7 — камера с канавками для НМ; 8 — проведение ИФА; 9 — учет результатов; К+, К-, ТС — тестированная отрицательная сыворотка; о — внутренний контроль.

3. Проведение исследования. Исследование в тест-системе «Вестернблот» проводится по стандартному протоколу непрямого ИФА.

1) Помещают по одной НМ в канавки камеры для проведения исследования. Добавляют в каждую канавку с НМ блокирующий буфер и инкубируют на шейкере (время и температурный режим инкубации указывается в каждой инструкции) для блокирования «пустот» на НМ. После инкубации удаляют блокирующий буфер из канавок.

2) Добавляют к НМ, в соответствии с протоколом, разведенные по инструкции тестируемые и контрольные (К+ и К) сыворотки. Заклеивают канавки липкой пленкой и инкубируют при заданном в инструкции режиме (температура, время) для образования специфических ИК.

3) Удаляют из канавок сыворотки и промывают НМ блокирующим буфером для удаления неспецифических ИК (объем буфера и число промываний указаны в инструкции). После последнего промывания НМ должны остаться в пустых канавках.

4) Готовят рабочее разведение конъюгата и добавляют в соответствии с инструкцией в каждую канавку. Заклеивают липкой пленкой и инкубируют при заданном в инструкции режиме (температура, время) для специфического мечения ферментом ИК, образовавшихся на НМ.

5) Удаляют конъюгат и промывают НМ блокирующим буфером для удаления неспецифически связавшихся молекул конъюгата (объем буфера и количество промываний указаны в инструкции). После последнего промывания НМ должны остаться в пустых лунках.

6) Готовят, согласно инструкции, субстратную смесь и добавляют ко всем НМ. Инкубируют в темноте (температура и время заданы в Инструкции) для проявления И К в ходе цветной реакции энзим-субстрат.

7) Останавливают реакцию добавлением стоп-реагента.

8) Вынимают НМ из канавок, помещают на фольгу и высушивают на воздухе.

9) Учитывают результаты визуально, сравнивая расположение окрашенных полос с таковым на шаблоне-фотографии, который прилагается к инструкции.

Каждая окрашенная полоса означает наличие в тестируемой сыворотке специфических Ат, образующих И К с Аг, расположенном в данном участке на НМ. Учет результатов можно автоматизировать, сканируя полоски с последующей программной обработкой на компьютере.

Результаты записывают в виде перечисления выявленных Ат к антигенам соответствующей молекулярной массы. На рисунке ниже представлены положительные результаты иммунодиагностики хронической инфекции, вызванной Helicobacter Pylori.

В настоящее время выпускаются различные тест-системы «Вестернблот», в которых с использованием соответствующих конъюгатов можно выявлять отдельные классы специфических IgM, IgG, IgA-AT к микробным Аг.

Тест-система «Вестернблот»
Выявление Ат класса IgG к Helicobacter pylory в тест-системе «Вестернблот».
Интерпретация результатов.
Каждая окрашенная полоса соответствует образовавшемуся ИК. Результат считается положительным при одновременном выявлении Ат к Аг (р-протеинам) с молекулярной массой — 120 кД, 87 кД, бб кД и 29 кД

- Читать далее "ИФА-ловушка для IgМ"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 31.08.2019

Остались вопросы или замечания?

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.