Впервые слияние протопластов было описано в 1976-1978 гг. сразу на нескольких видах бактерий. Позднее гибридизация бактериальных клеток путем слияния протопластов была осуществлена у большого числа видов многих родов. Целью разработки этой методики было получение гибридного потомства у микроорганизмов, не обладающих естественными природными системами генетического обмена.

Преодоление барьера нескрещиваемости достигается тем, что сливаются не интактные бактериальные клетки, а их протопласты (клетки без оболочки) или сферопласты (клетки, частично лишенные оболочки). Получение бактериальных протопластов — первый этап на пути осуществления их слияния. Чаще всего протопласты получают путем обработки бактериальных клеток лизоцимом, иногда используют в этих целях некоторые ферменты, выделенные из актиномицетов. В дальнейшем вся работа с протопластами проводится в гипертонических средах.

Лишенные оболочки бактериальные клетки легко сливаются в суспензиях с высоким титром протопластов. Следующим этапом является регенерация протопластов, т.е. восстановление бактериальной оболочки. И слияние, и регенерация осуществляются в средах, обогащенных органическими компонентами: обычно используются сыворотка крови, казаминовые кислоты, гидролизат казеина и др. Существенно повышает эффективность регенерации протопластов их инкубация в средах с этиленгликолем, применяемым и при работе с культурами клеток эукариотов. Способность к реверсии протопластов различается у разных видов бактерий. Обычно легче восстанавливаются грамположительные бактерии, поскольку их оболочка имеет более простое строение, чем оболочка грамотрицательных форм.

Рекомбинация между структурами ДНК происходит во время слияния протопластов, а выход рекомбинантов и их свойства оцениваются после реверсии протопластов. Обычно (хотя и не всегда) высокий выход рекомбинантов коррелирует с эффективной реверсией. Хотя частота получения рекомбинантов во многих случаях невелика, метод слияния протопластов имеет ряд преимуществ перед естественными системами гибридизации бактерий, даже перед конъюгацией. Во-первых, в случае слияния протопластов абсолютно отсутствует барьер нескрещиваемости, даже при совмещении очень далеких в систематическом отношении бактерий. Во-вторых, в данном случае взаимодействуют полные геномы и полные цитоплазмы слившихся клеток; возможно и множественное слияние клеток.

В результате при слиянии протопластов создаются возможности рекомбинации генетического материала с высокой частотой. В-третьих, возможен прямой обмен любыми плазмидами у бактерий, не имеющих природных систем их переноса.

Частоту образования рекомбинантов при слиянии протопластов можно повысить. Приблизительно десятикратное увеличение дает УФ-облучение бактерий до и во время их слияния. Повышают выход рекомбинантов и расширяют возможности подбора оптимальных условий культивирования сливающихся культур бактерий использование полиэтиленгликоля, обработка диметилсульфоксидом, оптимальная температура.

Процесс слияния протопластов, рекомбинация их генетического материала и формирование гибридных форм протекают в несколько стадий. При смешивании протопластов двух различных культур осуществляются случайные контакты протопластов разных форм. В ряде случаев при этом происходит эффективное слияние их цитоплазматических мембран, объединение цитоплазм разных клеток и рекомбинационные обмены между их хромосомами и плазмидами. Далее осуществляется сегрегация и регенерация гибридных конгломератов протопластов, причем последовательность этих двух процессов не установлена. Показано, что диплоидное (или полиплоидное) состояние слившихся протопластов реализуется разными способами.

Может сразу осуществляться рекомбинация — образуются стабильные ранние рекомбинанты или, если рекомбинация не происходит, выщепляются родительские формы. Диплоидное состояние может сохраняться довольно долго и после регенерации с выщеплением гетерогенных гаплоидных рекомбинантов.

Рекомбинантное потомство после слияния протопластов обычно очень вариабельно: можно получить любые сочетания родительских признаков. Механизмы рекомбинации при слиянии протопластов не выяснены; по-видимому, они отличаются от механизмов рекомбинационных процессов при естественных способах переноса генов у бактерий. В связи с этим данный метод гибридизации бактерий неудобен для их генетического анализа, однако он очень полезен для конструирования штаммов в практических целях.

Надо сказать, что в последнее время после обнаружения у бактерий широкотрансмиссивных плазмид, различных мигрирующих элементов и разработки методов генной инженерии способ гибридизации бактерий путем слияния протопластов во многом утратил свою значимость даже для практического получения штаммов. В то же время он может быть эффективен при создании межвидовых и межродовых гибридных форм, когда получение рекомбинантов затруднено или невозможно из-за отсутствия гомологии ДНК между репликонами родительских форм. В этих случаях при слиянии протопластов оказывается возможным получение рекомбинантов. Протопласты бактерий очень широко применяются при введении генетического материала реципиентам систематически далеких групп бактерий, когда природные методы гибридизации не работают.

- Читать далее "Бактериальные плазмиды: функции, задачи"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 14.07.2019