Тест на плазмокоагуляцию в идентификации микроорганизмов

Применяется в практической микробиологии преимущественно для внутривидовой дифференциации стафилококков и главным образом как один из наиболее достоверных признаков патогенности.

Тест основан на свертывании плазмы в результате продукции плазмокоагулирующим возбудителем тромбиноподобного вещества. Известны две формы плазмокоагулазы:
— связанная с клеточной стенкой микроорганизма;
— находящаяся в клетке в свободном виде.

Связанная коагулаза, или «хлопьеобразующий (clumping) фактор», воздействует непосредственно на фибриноген плазмы, вызывая склеивание бактерий. Свободная коагулаза действует на протромбин, способствуя образованию тромбиноподобного продукта, который, вступая во взаимодействие с фибриногеном, образует сгусток фибрина. Тест определения свободной коагулазы воспроизводится пробирочным методом. «Хлопьеобразующий фактор» определяют в слайд-тесте, который в 96% случаев совпадает с пробирочным тестом.

Техника постановки теста. Для постановки теста необходимо иметь: 1) исследуемую суточную культуру на плотной питательной среде; 2) кроличью плазму крови; 3) изотонический раствор натрия хлорида.

Для постановки теста можно использовать коммерческую сухую кроличью плазму с цитратом натрия или EDTA (этилендиамин-тетрауксусная кислота) или нативную плазму, получаемую в лабораторных условиях.

а) Получение нативной кроличьей плазмы. В стерильную пробирку с 1 мм 5% раствора натрия цитрата добавляют 9 мл крови, полученной из сердца или краевой вены уха кролика. Пробирку с кровью для осаждения эритроцитов центрифугируют при 3000 об/мин или ставят на 18-20 ч в холодильник. В результате над осадком эритроцитов образуется прозрачный слой желтоватой жидкости — плазма, свободная от эритроцитов.

Плазму асептически отсасывают пастеровской пипеткой, соединенной резиновой трубкой 25-30 см со стеклянной пипеткой для того, чтобы во время отсасывания плазмы содержимое пробирок было хорошо видно и кончик пастеровской пипетки не прикоснулся к осадку эритроцитов. Полученную плазму разливают по 0,5 мл в агглютинационные пробирки. В условиях холодильника пробирки с плазмой могут храниться 10 дней; в замороженном состоянии — несколько месяцев.

б) Постановка реакции плазмокоагуляции «хлопьеобразующего фактора» в слайд-тесте. На предметное стекло наносят 1 каплю неразведенной кроличьей плазмы и суспендируют в ней тщательно гомогенизированный материал исследуемой бактериальной колонии. Результат реакции учитывают в течение ближайших 10 с.

При положительном результате в однородной бактериальной суспензии образуются хлопья, которые при попытке гомогенизировать их бактериальной петлей не разрушаются и не исчезают.

При отрицательном результате реакции взвесь в течение всего времени наблюдения остается гомогенной.

Положительный контроль: Staphylococcus aureus.

Отрицательный контроль: S. epidermidis, S. saprophyticus.

в) Пробирочный метод реакции плазмокоагуляции. В пробирку с 0,5 мл неразведенной кроличьей плазмы вносят колонию испытуемого штамма стафилококка. Засеянные пробирки инкубируют в термостате при температуре 35(±1)°С до 24 ч. Наблюдение за посевами и учет результатов проводят через 1, 2 и 4 ч. Время наступления плазмокоагуляции соответствует уровню ферментативной активности микробов.

При положительном результате реакции жидкость превращается в желеобразную массу или сгусток, который не разрушается при легком встряхивании пробирки. При появлении сгустка через 2-4 ч от начала реакции пробирки вынимают из термостата и оставляют при комнатной температуре во избежание растворения его за счет стрептокиназоподобной активности исследуемой культуры стафилококка.

Если в течение первых 4 ч сгусток не образовался, посевы оставляют в термостате на 24 ч для окончательного учета результатов реакции.

При отрицательном результате сгусток не образуется, и при наклоне пробирки плазма свободно растекается по ее стенкам.

Примечание. Ложноотрицательные результаты плазмокоагуляции возможны в случае, если исследуемый штамм стафилококка продуцирует большое количество стафилокиназы, которая может растворить сгусток фибрина до учета реакции.

- Читать далее "Тест на определение подвижности бактерий"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 7.06.2019

Остались вопросы или замечания?

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.