После 30-минутного подсушивания приготовленной чашки со средой и наложенной на ее поверхность фильтрованной бумажки с антитоксической сывороткой приступают к посеву испытуемых культур. Посев делают непосредственно с кровяного теллуритового агара из отобранных колоний, подозрительных на С. diphtheriae. Частичка каждой колонии засевается в виде отдельной «бляшки» диаметром 1 см.

Между двумя «бляшками» испытуемых культур размещают «бляшки» контрольного, заведомо токсигенного штамма. Расстояние между «бляшками» — 0,5 см, между «бляшками» и фильтрованной бумажкой — 0,7 см. На одной чашке можно разместить посевы из 4 колоний — по 2 испытуемых с каждой стороны бумажки, помещая в промежутках и по краям «бляшки» с посевами контрольного штамма. В случае необходимости экономии питательной среды возможен иной вариант расположения посевов: с каждой стороны полоски — по 3 «бляшки» испытуемых культур и по 2 «бляшки» контрольного штамма между ними (т.е. по 6 посевов испытуемых культур на одной чашке).

Через 20-22 ч посевы просматривают на предмет появления тонких линий преципитации, образовавшихся в месте встречи токсина и антитоксина, диффундирующих в агаровую среду. Линии появляются между ростом «бляшек» и полоской фильтрованной бумажки с антитоксином, или с боков «бляшки». Вначале убеждаются в появлении преципитатов у контрольного штамма. Если они отсутствуют (что обычно свидетельствует о низком качестве питательной среды), то посевы оставляют в термостате еще на 24 ч.

Если же у контрольного штамма к этому сроку появились линии преципитации, то можно заметить преципитаты и у испытуемых культур. Если преципитаты не появились, то посевы сохраняют в термостате еще на 24 ч (всего 48 ч). По истечении этого срока (если линии преципитации не появились ранее), выдается окончательный ответ о наличии или отсутствии токсигенности у испытуемых культур. Возможно продление наблюдения еще на одни сутки.

При использовании дифтерийной антитоксической сыворотки «Диаферм-3» (но не коммерческого препарата «Антитоксин») могут возникнуть неспецифические (вторичные, «ложные») линии преципитации. Их появление связано с недостаточной очисткой антитоксической сыворотки от антител к бактериальным антигенам. Ложные линии могут появиться и у контрольного, и у испытуемых штаммов.

Неспецифические линии появляются позднее специфических, ответственных за токсин; они более тонкие и расположены ближе к бумажке. Определив специфическую линию у контрольного штамма, смотрим на ее расположение по отношению к линиям соседних испытуемых штаммов. Если линия преципитации испытуемой культуры сливается со специфической линией контрольного штамма, то ее тоже считают специфической, а культуру — токсигенной. Если линия (линии) испытуемой культуры идет наперекрест со специфической линией контрольного штамма, или смыкается с его неспецифической линией, то такие линии считаются ложными.

Наиболее четко феномен слияния наблюдается через 48 ч после посева (из-за чего может произойти задержка выдачи ответа о токсигенности испытуемой культуры).

Контрольный токсигенный штамм выделяют в лаборатории самостоятельно или получают из ГИСК им. Л.А. Тарасевича МЗ и СР РФ. Его хранят на питательном бульоне для дифтерийных коринебактерий (или бульоне Мартена) с 0,1% агар-агара и 10% нормальной сыворотки. Штамм пересевают 1 раз в месяц и периодически пассируют на кровяном агаре.

- Читать далее "Экспресс и серологическая диагностика возбудителя дифтерии (C. diphtheriae)"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 25.11.2019