Микобактерии лепры — Mycobacterium leprae (син.: микобактерия Хансена) впервые были обнаружены в 1873 г. норвежским ученым Армауэром Хансеном в препаратах тканей, взятых из очагов поражения у больных лепрой.

Несмотря на многочисленные попытки вырастить М. leprae in vitro, никому до сих пор этого сделать не удалось. Отсутствие методов культивирования М. leprae чрезвычайно затрудняет изучение биологических свойств этих бактерий, а также решение многих важнейших проблем практической лепрологии, например, разработку диагностикумов, получение профилактической вакцины, скрининг новых лекарственных средств, испытание М. leprae на лекарственную чувствительность и т.д.

При попытках изучения традиционными методами биохимических свойств М. leprae, выделенных из инфицированных тканей человека, исследователи сталкивались с проблемой недостаточного количества изучаемого материала. Поэтому всегда оставалось сомнение, не обусловлены ли получаемые результаты фрагментами клетки-хозяина, адсорбированными на поверхности бактерий. Hanks (1954) пришел к выводу, что М. leprae не способны самостоятельно использовать окружающие их субстраты для роста и размножения, чем и объясняется их внутриклеточный паразитизм и неспособность расти на микробиологических питательных средах in vitro. Однако позже Camargo et.al. (1974) показали, что М. leprae в буфере или специальной жидкой питательной среде, в которые добавляли ацетат или глицерин, меченные ¹⁴С, выделяли меченый углекислый газ (¹⁴CO₂), что указывало на их способность усваивать питательные вещества вне организма хозяина. При помощи радиоизотопного метода установлено, что М. leprae также инкорпорируют гликоген, аминокислоты, тимидин, пурины и неорганический фосфор, т.е. вещества, необходимые для активного синтеза нуклеиновых кислот и белков самой бактерии.

Знания о биологии возбудителя лепры значительно пополнились только с развитием электронной цитохимии, появлением высокоразрешающих электронных микроскопов и высокочувствительных радиоизотопных методов исследования.

М. leprae, по классификации Runyon et. al., 1974 (Определитель бактерий Bergey, 8th Ed.), относятся к роду Mycobacterium, порядку Actinomycetalis, семейству Mvcobacteriacae.

Микобактерии лепры обычно имеют вид прямой или изогнутой палочки с закругленными концами, неподвижны, типичных спор не образуют; длина микобактерий — 1-7 мкм, диаметр — 0,2-0,5 мкм.

М. leprae, подобно возбудителю туберкулеза, относится к группе кислотои спиртоустойчивых грамположительных микобактерий. По Цилю-Нельсену окрашиваются в ярко-красный цвет. Являются внутриклеточными паразитами системы мононуклеарных фагоцитов. В лепрозных поражениях, наряду с палочковидными гомогенно окрашенными микобактериями, встречаются также фрагментированные и зернистые формы. В теле фрагментированных палочек содержится 2-5 более плотных зернышек, разделенных слабоокрашенными или неокрашенными промежутками. Нередко палочки М. leprae раздуты, напоминают колбы, запятые, восклицательные знаки, имеют гантелевидную форму, что некоторыми исследователями рассматривается как инволютивная форма.

В определенных условиях микобактерии лепры могут утрачивать кислотоустойчивость, оставаясь грамположительными. Длительное пребывание мазков на солнце или в растворе формалина, воздействие антилепрозными препаратами приводят к снижению или исчезновению кислото- и спиртоустойчивости М. leprae. В 1971 г. было показано, что обработка пиридином приводит к потере способности М. leprae к окрашиванию карболовым фуксином. Этот феномен стал одним из способов идентификации возбудителя лепры.

На ультраструктурном уровне М. leprae по строению принципиально не отличаются от других микобактерий. Поверхность микроорганизма представлена электронно-плотной бахромчатой микрокапсулой толщиной 5-15 нм. Установлено, что микрокапсула в основном состоит из мукополисахари-дов; она в значительной степени определяет антигенность и формирование лекарственной устойчивости микобактерий. Под микрокапсулой определяется трехслойная клеточная стенка (толщиной 8-20 нм), состоящая из наружного осмиофобного слоя и двух плотно прилегающих друг к другу осмиофильных слоев. Клеточная стенка обладает выраженной ригидностью, устойчивостью к деформации и химическим воздействиям; она хорошо сохраняется в лепрозно пораженных тканях даже при полном лизисе цитоплазмы М. leprae («клетки-тени»).

К внутренней поверхности клеточной стенки примыкает трехслойная плазматическая мембрана (элементарная мембрана Робертсона), внутренний слой которой плотно связан с цитоплазмой бактериальной клетки. В цитоплазме выявляется небольшое число (1-2) мезосом, представляющих собой инвагинаты в цитоплазму плазматической мембраны и характеризующихся выраженным полиморфизмом (петлевидные, гроздевидные, трубчатые). Собственно цитоплазма представлена мелкогранулярным умеренно электронно-плотным веществом, в котором находятся рибосомы, небольшие электронно-плотные включения волютина, включения типа вакуолей (предположительно, липидные), крупные гомогенные включения невыясненной природы, а иногда так называемые спороподобные тельца.

В центре бактериальной клетки вдоль ее длинной оси находится трудновыявляемый нуклеоид (генофор), который не имеет строго определенной формы, не ограничен мембраной, представляет собой свободно «плавающий» в цитоплазме конгломерат тонких и умеренно плотных нитей кольцевидной ДНК, как и у других прокариотов, точечно связанных с плазматической мембраной.

Спороподобные образования выявлены в ультратонких срезах М. leprae, взятых от больных лепроматозным типом лепры, длительно, но безуспешно лечившихся различными противолепрозными препаратами, главным образом сульфонами. Как и в материале от нелеченых больных, в этих препаратах, наряду с микобактериями, у которых сохранены все структурные компоненты, выявлялись и «клетки-тени», представленные на элетронограммах только микрокапсулой и клеточной стенкой при полностью лизированном протопласте. Особенностью популяции микобактерий от сульфоноустойчивых больных является наличие в некоторых лизирующихся бактериальных клетках спороподобных телец, представляющих собой отграниченые трехслойной мембраной сферические участки нормальной цитоплазмы. Этот процесс напоминает начальную стадию образования спор у заведомо спорообразующих бактерий.

Однако от истинных зрелых спор эти образования отличаются тем, что и в более поздних стадиях, когда наступает полный лизис цитоплазмы бактериальной клетки, поверхностные структуры у них, как правило, представлены только одной «элементарной» трехслойной мембраной по типу проспоры, т.е. здесь отсутствуют экзоспориум, экзина и интина, составляющие поверхностные структуры истинных спор. Правда, в очень редких случаях удавалось наблюдать спороподобные тельца, ограниченные не двуконтурной (т.е. трехслойной) мембраной, а равномерной гомогенной оболочкой толщиной 100-175 нм, несколько более осмиофильной, чем заключенный в ней материал, и напоминающей оболочку истинных спор. Возможно, что это следующий этап развития спороподобных образований микобактерий лепры.

Спороподобные тельца хорошо сохраняются при полном лизисе остальной части цитоплазмы бактериальной клетки. Очевидно, что интактные микобактерии лепры с лизированной цитоплазмой, содержащие описанные спороподобные тельца, в светооптическом микроскопе будут иметь вид «зернистых» и «фрагментированных» клеток. Но название этих образований «спороподобные» предполагает, что они могут дать начало новой вегетативной клетке, т.е. имеют вполне определенное назначение — сохранение вида М. leprae. В таком случае выявляемая светооптически «зернистость», «фрагментация» или «глыбчатая коагуляция» цитоплазмы микобактерий Хансена не всегда является показателем потери ими жизнеспособности.

Недавно (1996) возможность формирования спороподобных структур была подтверждена J. Gomez, J. De Maio, С. Ко и W. Bishai, которые сообщили об обнаружении ими в геноме М. tuberculosis и М. leprae генов sigF и whiB, являющихся регуляторными генами спорообразования у Bacillus subtilis и Streptomyces coelicolor.

М. leprae отличаются необычно длинным для бактерий циклом размножения; время их генерации (скорость одного деления) — около 12 сут. Микобактерии лепры в наибольшем количестве обнаруживаются в поверхностно расположенных участках организма (кожа, слизистая носа, периферические нервы, особенно поверхностные), что предполагает предпочтение возбудителем лепры температуры ниже 37°. Позднее это было подтверждено экспериментами на мышах, а также получением генерализованной инфекции при заражении девятипоясных броненосцев, отличающихся естественной нивкой температурой тела.

Размножаются М. leprae поперечным делением на 2-3 дочерние клетки и, оставаясь на месте, постепенно образуют типичные скопления с характерным расположением «сигар в пачке». В редких случаях встречается размножение путем почкования и ветвления.

Методами электронной микроскопии установлено, что М. leprae так же, как и растущие на средах микобактерии, обладают достаточно выраженной активностью ферментов окислительного фосфорилирования, т. е. имеют автономные системы дыхания, что свидетельствует о перспективности дальнейшего поиска методов их культивирования in vitro.

Многократное пассирование возбудителя лепры на мышах и крысах сопровождается повышением вирулентности микобактерий для животных, сокращением инкубационного периода болезни и генерализацией инфекции, а также изменением соотношения высших жирных кислот в составе М. leprae. При заражении мышей М. leprae, выделенными из тканей человека, микроорганизм, проходя через фазу покоящихся клеток в процессе первого пассажа к третьему (через 1,8-2 года), окончательно адаптируется к новому хозяину, подтверждением чего может служить формирование микрокапсулы, а также появление зерен «волютина» в микобактериальных клетках третьего и последующих пассажей.

М. leprae имеют определенные отличия от других микобактерий, заключающиеся в размере генома, характерных составах генома (56% гуанин+цитозин, тогда как у других видов — 64-70%) и пепгидогликана клеточной стенки (преобладание L-формы глицина над D- и L-формами аланина), а также в присутствии специфического фенольного гликопида-1.

На основании данных о генах рибосомальной РНК было подтверждено, что микобактерия лепры принадлежит к группе медленно растущих микобактерий, видоспецифическими признаками которой принято считать наличие диоксифенилаланиноксидазы (ДОФА-оксидазы) и своеобразный набор миколовых кислот. В то время как для других микобактерий характерно присутствие трех типов микозидов, ковалентно связанных с клеточной стенкой, у М. leprae имеются лишь 2-альфа-миколаты и кетомиколаты, отсутствует дикарбоксимиколаты.

Микобактерии характеризуются набором липидов, которые входят в состав клеточной стенки или секретируются в окружающую среду. Два из этих липидов, располагающиеся преимущественно внеклеточно, обладают особенностями, специфичными только для микобактерии лепры, по которым ее можно отличить от других микобактерий. Первый липид — это серологически активный гликолипид фенол-гликольного типа (ФГЛ-1), сходный с микозидом A Mycobacterium kansasii, но содержащий уникальный трисахарид, в состав которого входят 2,3-ди0-метилрамноза, 3-0-метилрамноза и 3,6-диметилглюкоза. Живые микобактерии лепры секретируют гликолипид локально, здесь он аккумулируется и вполне может быть составляющей характерного пенистого материала в макрофагах («лепрозные клетки», «пенистые клетки» или клетки Вирхова) у больных лепроматозным типом лепры.

Второй липид из М. leprae, представляющий особый интерес, — это фтиоцерол-демикоцерозат, который структурно весьма схож с гликолипидом, но не содержит углевода.

Хотя из М. tuberculosis и других видов микобактерий был также выделен фтиоцерол-демикоцерозат, он химически значительно отличается от полученного из М. leprae.

В 1967 г. впервые описана ДОФА-оксидаза М. leprae — фермент, идентифицированный впоследствии как О-дифенолоксидаза. Получено достаточно много данных, свидетельствующих о важной роли О-дифенолоксидазы в сохранении жизнеспособности и процессах размножения М. leprae. Высказывалось предположение, что в клетках возбудителя лепры, которые характеризуются низким уровнем активности их цитохромной и флавопрогеидной систем, ДОФА-хинон, образующийся при участии О-дифенолоксидазы из ДОФА, выступает в качестве переносчика электронов в альтернативном дыхательном пути. Установлено также, что, окисляя ДОФА, синтезируемый в меланоцитах кожи, ДОФА-оксидаза М. leprae участвует в формировании таких клинических проявлений лепры, как гипопигментация кожи. Радиоизотопными методами показана прочная связь ДОФА-оксидазы с поверхностными органоидами М. leprae, однако, в каких именно морфофункциональных структурах бактериальной клетки локализуется этот фермент, остается невыясненным.

М. leprae обладают более низким уровнем супероксиддисмутазы и пероксидазы по сравнению с другими микобактериями, при этом у них отсутствует каталаза. М. leprae утилизируют глюкозу и глицерин в качестве источников энергии, у них так же, как и у других микроорганизмов, обнаружены все ключевые ферменты, участвующие в процессе гликолиза. Были выделены также специфические ферменты для окисления глицерина.

Устойчивость к факторам внешней среды. В 40%-ном растворе глицерина при комнатной температуре М. leprae сохраняют жизнеспособность не менее 10 лет. Температурные условия хранения тканей лепром не имеют существенного значения. На протяжении первых месяцев и даже лет эксперимента характеристики размножения М. leprae в тканях мякоти лап мышей не изменялись. То есть продемонстрировано, что М. leprae, находясь во внешней среде, могут в течение многих лет оставаться жизнеспособными.

М. leprae для исследовательских целей успешно сохраняют при температуре от -15° до —60°С, используя в качестве протективного агента диметил сульфоксид. При транспортировке в лаборатории для исследования сосуд с суспензией М. leprae или тканями от больных помещают в мокрый лед. Потери жизнеспособности не отмечается в течение 7 дней.

Жизнеспособность микобактерий лепры, замороженных при -80°С и затем подвергнутых оттаиванию, значительно снижалась, если судить по результатам роста в подушечке лапки мыши, при этом резко сокращалась их метаболическая активность.

В выделениях из носа М. leprae вне организма при средней температуре 20,6°С и влажности 43,7% сохраняют жизнеспособность до 7 дней, при средней температуре 36,7° и влажности 77,6% — до 9 дней.

- Читать далее "Антигены и генетика возбудителя лепры (M. leprae)"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 6.12.2019