Советуем для ознакомления:

Лаборатория:

Популярные разделы сайта:

Определение белковых фракций. Техника определения белковых фракций

Один из новейших приборов типа ПЭФ для разделения белков и других подвижных соединений на фракции выпущен в 1960 г. заводом физических приборов г. Фрунзе.
Прибор состоит из электрофоретической камеры и источника питания.

В электрофоретической камере исследуемое вещество разделяется на фракции в электростатическом поле, которое возникает между электродами, помещенными в буферный раствор.
Одновременно в камере можно провести на бумажных полосках пять исследований.

Источник питания подключается к сети переменного тока, напряжения 127 или 220 вт, и дает необходимое стабилизированное напряжение тока.
Предложенный Е. А Бердакиной (Украинский научно-исследовательский институт клинической медицины им. Н. Д. Стражеско) прибор для определения белковых фракций в сыворотке крови весьма прост и удобен для этой цели.

Прибор представляет собой прямоугольный сосуд из плексигласа, размеры его 18X18X32 см. Внутри прибора имеются 4 кюветы для буферного раствора, по 2 кюветы у каждой боковой стенки. Каждая кювета имеет размеры 5 см высоты и 4 см ширины.

белковые фракции

Смежные кюветы соединяются полосками фильтровальной бумаги. В крайние кюветы вмонтированы угольные электроды, применяемые в киноустановках, освобожденные от листочков, меди. Они лучше обычных угольных электродов потому, что на них не отлагаются кристаллы солей.

По длине сосуда с двух сторон, на расстоянии 19—20 см друг от друга и на высоте 12,5 см от кювет, вклеены небольшие пластинки с углублением для рамки, составленной из кусочков плексигласа. В рамке просверлены небольшие отверстия для натягивания капроновых нитей на расстоянии в 2 см.

Прибор соединен с вольтметром, миллиамперметром и выпрямителем тока. Во время работы прибор накрывается стеклом, под которое подкладывается фильтровальная бумага для поглощения излишней влаги. Для электрофореза применяется мединал-верональный буфер рН = 8,6 ионной силы 0,1. Количество бумажных полос для опыта — 2—3, ширина их — 4 см, длина — 44 см. Уровень буфера в кюветах поддерживается сифоном.

При электрофорезе рН буфера в крайних кюветах уже после одного опыта изменяется. Для точности определения рекомендуется менять буфер в крайних кюветах после однократнога опыта, а во внутренних — после трехкратного электрофореза.

Сыворотку — 0,02 мл — наносят микропипеткой от прибора Сали осторожно на край покровного стекла в виде полоски, а оттуда, слегка наклоняя стеклышко, на пропитанную буфером бумажную ленту на расстоянии 5—6 см от катодного конца рамки.

Место нанесения сыворотки отмечается заранее карандашом. Бумагу надо увлажнять буфером равномерно. Рекомендуется мокрую бумажную ленту слегка просушить между сложенным листом фильтровальной бумаги. Пропитанная буфером лента должна быть натянута на рамке, чтоб избежать сближения фракций.

Электрофорез проводят 17—18 часов при 250—300 вт. После электрофореза концы вынутых из камеры полос отрезаются, чтоб прекратилось сифонное действие буфера, бумажные ленты помещаются на 20 минут в сушильный шкаф при температуре 115—118°С для фиксирования белков, после чего они окрашиваются.

Методы окрашивания:
1. Окраска бромфенолом синим по Гурвичу.
Состав красителя:
Бромфенол синий — 0,05 г
Сулема — 1 г
Уксусная кислота ледяная — 2 мл
Дистиллированная вода — 98 мл
Избыток краски с бумаги смывают 4—5 раз 2% раствором уксусной кислоты до исчезновения окраски промывной жидкости. Влажные ленты просушивают между листами фильтровальной бумаги, а потом на воздухе.

2. Окраска амидошварцем «В».
Насыщенный раствор краски амидошварц «В» в метаноле, содержащем 10% уксусной кислоты. Окрашивают в течение 10 минут, затем электрофореграммы промывают метиловым спиртом, содержащим 10% уксусной кислоты.

3. Окраска азокармином «В». Метанол — 100 мл Уксусная кислота — 10 мл Дистиллированная вода — 90 мл. Краска азокармин «В» — до насыщения.
После 15-минутного окрашивания электрофореграммы помещают на 15 минут для фиксирования в метанол, затем отмывают разбавленным в 3 раза метанолом, содержащим 1 % уксусной кислоты.
На ленте получается 5 фракций.

- Читать далее "Расчет белковых фракций. Реактивы для определения сахара крови"

Оглавление темы "Методы исследования крови":
1. Предохранение крови от свертывания. Реакция оседания эритроцитов
2. Определение осмотической резистентности эритроцитов. Определение времени кровотечения
3. Определение времени свертывания крови. Определение ПТИ
4. Определение времени рекальцинации. Определение устойчивости плазмы к гепарину
5. Осаждение белков крови. Методы осаждения белков крови
6. Рефрактометрия для определения белков крови. Погружной рефрактометр Пульфриха
7. Определение небелковых тел крови. Определение альбуминов и глобулинов
8. Определение белковых фракций. Техника определения белковых фракций
9. Расчет белковых фракций. Реактивы для определения сахара крови
10. Техника определения сахара крови. Лабораторный метод определения глюкозы крови