Микробиологическое исследование включает выделение возбудителя с целью диагностики заболевания у людей и животных, а также для эпидемиологического расследования при осложнении ситуации. Кроме того, используются иммунологические методы с целью выявления антител и антигенов.

а) Бактериологическое исследование иерсиний. С учетом биологии возбудителей псевдотуберкулеза и иерсиниоза бактериологическое исследование материала от больных людей, животных и объектов окружающей среды проводят с использованием одних и тех же сред накопления и плотных питательных сред для их выращивания. Исследуют различный материал от больных людей, животных и различных объектов внешней среды.

Подготовка материала для посева:

Пищевые продукты:

— Корнеплоды (морковь, редис и др.), фрукты (в том числе цитрусовые), овощи (помидоры, огурцы свежие), яйца (неповрежденные). Все перечисленные продукты в количестве 5-10 штук тщательно обмывают тампоном и помещают в емкости с 50 мл среды подращивания.

— Овощи — лук зеленый, репчатый, листья салата, зелень, 1 -2 верхних листа капусты разрезаются на несколько частей. Подготовленные объекты помещают в специальные емкости и заливают средой подращивания на 2-3 см выше уровня материала.

— Сыр, творог, брынза, колбаса, сосиски, масло сливочное, кремы, 25,0-30,0 г (или порция), измельчают и помещают в стеклянные емкости с 50 мл среды подращивания;

— Молоко, сметана, рассол, компот, соки, 5-10 мл, помещают в 50 мл среды подращивания.

— Воду питьевую фильтруют через ватный тампон или обычные санитарно-бактериальные фильтры, которые помещают в 50 мл среды подращивания.

При поступлении пробирок со смывами (тампонами), сделанными на месте взятия материала с поверхностей различных объектов окружающей среды, рук или зева персонала пищеблоков либо с овощей, в них добавляют 4-5 мл среды подращивания (на 2 см выше тампона).

Испражнения: 0,5-1,0 г испражнений помещают в пробирку с 5 мл среды накопления. Если материал доставлен в пробирке с тампоном (петлей), необходимо долить их средой накопления на 2-3 см выше тампона.

Моча: осадок после центрифугирования доливают средой подращивания 1:5. При исследовании цельной мочи 50 мл разводят 1:1 средой подращивания.

Кровь (в первые дни заболевания) засевают в бульон. При необходимости серологического исследования вначале после свертывания используют сыворотку. Для посева используют сгусток, который измельчают и заливают 5 мл бульона.

Органы и ткани, взятые при операции людей, от животных или трупов людей измельчают. Каждый отдельно по 1,0-1,5 г помещают в среду подращивания.

В практической работе целесообразно использовать следующую схему бактериологического исследования.

Первый день. После предварительной подготовки материала его заливают средой подращивания. Для этого используют следующие среды — пептонно-калиевую, буферную пептонную воду или буферно-казеиново-дрожжевую. Материал ставят в холодильник и выдерживают в нем до положительного высева.

Второй — третий день. Из сред подращивания делают первый высев на плотные питательные среды. Для этого бактериологической петлей из верхней трети слоя среды (но не с поверхности), не взбалтывая содержимое пробирок, засевают материал частыми штрихами на плотные дифференциально-диагностические среды: Эндо, СБСТ, селективный дезоксихолатный агар. Из пробирок с посевом крови делают высев на чашки со слабощелочным агаром.

Чашки с посевом ставят в термостат при 22°С, чашки со средой СБСТ — при 37°С. Исходный материал хранят в холодильнике.

Третий — четвертый день. Посевы на плотных питательных средах просматривают визуально, в том числе и через лупу, или в микроскопе с малым увеличением, снимают по 3-4 подозрительные колонии.

Колонии иерсиний на СБСТ через 48 ч инкубации при 37°С — зеленовато-синего цвета. Колонии энтеробактерий в зависимости от гидролиза мочевины могут быть синего цвета (клебсиеллы, протеи) или при отсутствии гидролиза — ярко-желтого (шигеллы, сальмонеллы, эшерихии).

На среде Эндо через 48 ч при 22°С вырастают колонии — мелкие круглые выпуклые блестящие с ровным краем. Колонии Y. pseudotuberculosis — бесцветные, Y. enterocolitica — слабо-розоватого цвета.

Колонии, имеющие вышеописанную характеристику, отсевают на плотные слабощелочные среды (МПА, агар Хоттингера). Для исключения протеев, алкалигенес колонии засевают также в пробирки с маннитом и мочевиной, ставят пробу на оксидазу.

Если в чашках с плотными средами не обнаружен рост колоний, посев повторяют из исходного материала, который после высева вновь помещают в холодильник (и так повторяют до 7-го дня, в некоторых случаях — до 10-го).

Четвертый — пятый день. Культуры с положительной пробой на разложение маннита, уреазу и отрицательной на оксидазу подлежат дальнейшей идентификации. Для этого материал засевают в среды Гисса, используя основные биохимические свойства бактерий, указанные в таблице ниже, и дополнительно — в пробирки со скошенным слабощелочным агаром. Пробирки помещают в термостат при 37°С (возможна инкубация при 22-25°С, но у некоторых субстратов при этой температуре реакция задерживается). Пробы на подвижность и реакцию Фогес — Проскауэра культивируют при температуре 22 и 37°С. Скошенный агар помещают при температуре 22-25°С в термостат. Для биохимической идентификации можно использовать систему API 20Е (bio-Merieux).

Пятый — шестой день. Проводят учет результатов биохимических рядов. При обнаружении культур со свойствами, соответствующими возбудителям иерсиниоза или псевдотуберкулеза, определяют серовар в реакции агглютинации (РА) с культурой, выросшей на скошенном агаре. РА ставится на стекле по общепринятой методике с диагностическими сыворотками к Y.pseudotuberculosis (0:1, 0:3 сероваров) и к Y.enterocolitica к штаммам сероваров: 0:3; 0:4,32; 0:5,27; 0:7,8; 0:8; 0:6,30; 0:9, а также в случае необходимости к штаммам Y.enterocolitica — 0:5; 0:4,33; 0:13,7. По результатам дают ответ. Специфические сыворотки производит НИИЭМ им. Пастера (С.-Петербург).

Культуры, имеющие отклонения, подвергают дальнейшему исследованию. Если не выделена культура, повторяют высев из исходного материала.

Каждый раз при повторном высеве материала на плотную питательную среду целесообразно применять методику щелочной обработки. Для посевов крови, мочи и слизи зева щелочная обработка не требуется. В лунку полистироловой пластинки наливают 0,2 мл рабочего раствора щелочи, затем вносят две полные петли (0,2 мл) исследуемого материала, перемешивают и через 3-5 мин все содержимое лунки высевают на бульон Хоттингера. Посевы помещают в термостат при 22-25 или 37°С. Далее анализ проводят по схеме, указанной ранее.

Седьмой — десятый день. Для дифференциации штаммов Y. enterocolitica вирулентных и авирулентных вариантов проводят пробы, принятые в практике: аутоагглютинации и температурозависимой морфологии колоний. Другие тесты — заражение лабораторных животных, заражение монослоев перевиваемых культур (НЕр-2, HeLa) — возможны в специализированных институтах.

Тесты аутоагглютинации основаны на наличии у патогенных иерсиний плазмиды вирулентности pYV. Для постановки теста аутоагглютинации культуры Y. enterocolitica высевают на бульон Хоттингера и инкубируют при 26°С в течение 24 ч. Затем делают пересев на агар Хоттингера для получения изолированных колоний и инкубируют при той же температуре в течение 48 ч.

Для каждого штамма отбирают по 10 колоний и пересевают каждую в 2 пробирки со средой Кларка. Посевы инкубируют при 37 и 26°С. Результат учитывают через 24-48 ч.

Реакция аутоагглютинации считается положительной (наличие pYV+ иерсиний), если в 9 из 10 пробирок, инкубированных при 37°С, среда остается прозрачной или наблюдается легкое помутнение при наличии рыхлого хлопьевидного осадка в результате спонтанного склеивания клеток иерсиний, обусловленного гидрофобными белками на их поверхности. В пробирках, инкубированных при 26°С, отмечается равномерное помутнение среды и компактный осадок на дне, хлопья отсутствуют.

При отрицательном результате в пробирках, инкубированных при той и другой температурах, отмечается помутнение среды, хлопья отсутствуют.

Для оценки патогенных свойств выделенных Y.enterocolitica используется также иммунологический метод, основанный на выявлении белков наружной мембраны (антигенов вирулентности). Сыворотку получают иммунизацией кроликов вирулентным штаммом, содержащим pYV+ (сыворотка выпускается НИИЭМ им. Пастера, С.-Петербург). Для постановки реакции культуру иерсиний засевают на агар Хоттингера и инкубируют при 37 и 26°С в течение 18-24 ч.

Реакция ставится на стекле. Это помогает выявить патогенные штаммы среди гетерогенных по этому признаку штаммов Y. enterocolitica, циркулирующих среди грызунов и объектов внешней среды.

б) Определение чувствительности к антибиотикам. Для установления антибиотикочувствительности штаммов Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica применяется общепринятая методика «диффузии в агаре». Стандартные диски с антибиотиками помещают на чашки со средой, засеянной «газоном» изучаемой культурой. Учет проводят через сутки инкубирования в термостате при температуре 37°С. По ширине образовавшейся зоны задержки роста определяют степень чувствительности к данному антибиотику. Возможно использование методики разведений.

в) Экспресс-диагностика иерсиний. Выявление антигенов иерсиний. Выявление специфических антигенов бактерий является перспективным для ранней диагностики. К настоящему времени применительно к иерсиниям разработаны следующие методы.

Метод флюоресцирующих антител (МФА), основанный на взаимодействии специфического антигена с антителом, меченным флуорохромом (РосНИПЧИ «Микроб», Саратов). При положительной реакции образуется комплекс, выявляемый по флуоресцентной метке при исследовании под люминесцентным микроскопом.

Метод коагглютинации (РКоА), позволяющий выявлять микробные антигены, а также связанные антигены в составе иммунных комплексов.

Реакция агглютинации латекса (ЛА) для выявления антигенов возбудителей псевдотуберкулеза в конрофильтратах больных и в объектах внешней среды. Диагностикум выпускается НИИВС (С.-Петербург).

Тест-система ИФА для выявления антигенов Y.pseudotuberculosis 01 серовара (выпускается ФГУП НИИЭМ им. Пастера, С.-Петербург).

Генетические методы. ТЩР-анализ, был испытан для ранней диагностики псевдотуберкулеза, расследования вспышек, для выявления циркуляции иерсиний среди грызунов; он показал диагностическую ценность. Но этот метод пока еще не внедрен в практику. Имеются лишь единичные сообщения об его использовании.

г) Серологическая диагностика иерсиний. Серологическое исследование проводится в случае обследования больных, здоровых людей, а также животных.

Кровь для исследования берут из вены или пальца, собирают в стерильную пробирку, помещают в термостат при 37°С на 30-60 мин для образования сгустка. Затем сгусток отделяют от стенок и пробирку переносят в холодильник. Возможно отделение сгустка центрифугированием. Из полученной сыворотки делают двукратные разведения, начиная с 1:100.

Используют реакцию агглютинации с типовым или аутоштаммом, а также реакцию гемагглютинации с коммерческими диагностикумами — псевдотуберкулезным или кишечно-иерсиниозным 03 и 09. Диагностикумы выпускает НИИВС (С.-Петербург).

Начальным диагностическими титром считается разведение 1:200 для РА и 1:160 — для РИГА при наличии реакции на 3 или 4 креста. Для подтверждения диагноза необходима оценка динамики титра антител в повторном исследовании сыворотки на 10-14-й день заболевания.

- Вернуться в оглавление раздела "Медицинская микробиология"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 3.1.2020