а) Прямые методы микробиологической диагностики боррелиозов включают визуализацию спирохет под микроскопом в витальных или фиксированных препаратах. Живые боррелии можно видеть при помощи темнопольной или фазово-контрастной микроскопии препаратов при сравнительно небольшом общем увеличении (х600-700). Однако при ИКБ накопление боррелий в биологических жидкостях обычно невелико, а при АКБ на пике лихорадки наблюдается интенсивная боррелиемия, но и в этот период форменные элементы крови сильно осложняют обнаружение возбудителя.

По этим причинам микроскопия витальных препаратов не применяется как метод лабораторной диагностики заболевания. Она используется для контроля роста боррелий при их культивировании, а также как один из эффективных методов их обнаружения в материале из кишечника зараженных клещей до начала их питания. Фиксированные препараты окрашивают по Романовскому-Гимзе и выявляют боррелий светлопольной микроскопией. Их можно обнаружить также в гистологических препаратах различных тканей, импрегнированных серебром по методу Fontana в одной из его модификаций (например, усовершенствованным методом Warthin, который отличается сравнительной простотой и позволяет работать с материалом, содержащим костные элементы).

При ИКБ эффективность применения этих методов также ограничена указанными выше причинами. При АКБ лихорадочный цикл заболевания, как уже упоминалось, сопровождается интенсивной боррелиемией. Поэтому обнаружение возбудителя в окрашенных мазках «толстой капли» крови пациентов было и остается одним из наиболее простых и дешевых методов лабораторной диагностики этих заболеваний.

б) Бактериологический метод. Хотя боррелии размножаются на специальной жидкой или полутвердой среде, культуральный метод редко применяется в клинической лабораторной диагностике боррелиозов из-за его длительности, дороговизны и небольшой результативности. Использование этого метода, как правило, ограничено специальными диагностическими или исследовательскими задачами, например, при необходимости верификации серонегативного боррелиоза или дальнейшего углубленного изучения особенностей этиологического агента заболевания. Возбудитель может быть изолирован из крови, кожных или синовиальных биоптагов, спиномозговой и синовиальной жидкостей, а также некоторых других материалов, взятых у больного.

в) Определение чувствительности к антибиотикам. Изучение чувствительности В. burgdorferi sensu lato к антибиотикам in vitro проводится по двум критериям: минимальной ингибирующей концентрации (МИК) и минимальной боррелицидной концентрации (МБК) антибактериальных агентов, причем спектр испытанных препаратов остается еще очень неполным. Условия аранжировки экспериментов, несмотря на некоторые попытки, пока не стандартизированы, и в практической лабораторно-диагностической работе эти тесты не применяются.

Эксперименты по действию различных антимикробных препаратов на боррелий in vivo, направленные на отработку оптимальных схем лечения, обычно проводятся на лабораторных хомяках, а в клинических испытаниях участвуют больные люди. При этом на хомяках проверяется эффективность элиминации боррелий из тканей (за исключением ЦНС) при различной дозировке препарата, а у людей адекватность терапии оценивают на основе анализа клинической картины и симптомов заболевания. Боррелии чувствительны к тетрациклинам, пенициллинам, цефалоспоринам, макролидам.

г) Методы экспресс-диагностики, генодиагностика. Несмотря на значительный прогресс в применении современных молекулярно-биологических методов для лабораторной диагностики инфекционных заболеваний, применительно к боррелиозам единственным методом, который в полной мере можно считать экспресс-диагностическим, остается выявление возбудителей АКБ и эпидемического возвратного тифа в фиксированных мазках «толстой капли» крови пациентов. Однако этот метод не эффективен для лабораторной диагностики ИКБ из-за слабой боррелиемии при этих инфекциях.

Из генодиагностических методов наибольшую популярность получила полимеразная цепная реакция (ПЦР). По отношению к боррелиозам она имеет существенные ограничения, связанные с недостаточным или кратковременным накоплением возбудителя или его ДНК в биологических жидкостях и тканях, пробы которых можно получить для исследования без специальных и обычно болезненных процедур. Аналитическая чувствительность ПЦР — приблизительно 10-20 боррелий в исследуемом образце. Такая сравнительно высокая чувствительность, а также специфичность метода могут быть потеряны из-за частой контаминации продуктами амплификации, что способствует получению ложноположительных результатов, а также из-за ложноотрицательных реакций, вызванных ингибицией.

В целом только при детекции ДНК боррелий в биопсийных образцах из синовиальной полости при артрите, а также в кожных биоптатах эффективность ПЦР несколько выше таковой культурального метода. Поэтому даже при правильном подборе праймеров положительный результат ПЦР удается получить далеко не во всех случаях клинически бесспорного боррелиоза.

Такой результат служит лабораторным подтверждением диагноза, но отрицательный результат ПЦР не является показателем отсутствия заболевания. Кроме того, как в нашей стране, так и за рубежом, пока не стандартизованы разные этапы проведения ПЦР (выделение ДНК из различных биологических образцов, режим амплификации и др.), что очень осложняет применение ПЦР (в частности в реальном времени) в практических клинико-диагностических лабораториях. Тем не менее этот метод позволяет (с разной результативностью) получить из биоматериала пациента (включая кровь в остром периоде заболевания) ампликоны определенных видоспецифических участков генома боррелий. После необходимой проверки их специфичности гибридизацией с соответствующим зондом (или эквивалентным методом) они могут быть подвергнуты секвенированию.

Две последние процедуры очень важны для уточнения геновидовой принадлежности возбудителя или, иными словами, для окончательного определения этиологии заболевания. Для амплификации специфической ДНК боррелий используют праймеры и зонды различного дизайна, например, области межгенного спейсера 5S-23S рРНК, участка гена 16S рРНК, последовательности хромосомных генов fla, р66 или плазмидных генов ospA, ospB.

д) Серологическая диагностика. Особенности иммуногенеза при И КБ, в частности интенсивность образования антител разных классов и степень их специфичности, существенно различаются на разных стадиях клинического течения. Это определяет неравнозначные возможности серологических тестов, что должно учитываться при выборе тактики их применения. Большое значение имеют также зависимость антителогенеза от общего иммунного статуса больного, предшествующее применение терапевтических средств, особенно антибиотиков, и другие факторы.

Почти все серологические реакции сводятся к выявлению специфических антител IgM и TgG-класса. В диагностической практике наиболее распространены иммунофлюоресцентные и иммуноферментные тесты (в многочисленных модификациях), а также иммуноблоттинг, позволяющий одновременно определять антитела к нескольким антигенам (протеинам). Ни одна из известных серологических реакций не позволяет с равной эффективностью выявлять антитела на всех этапах иммуногенеза. Поэтому универсального референс-теста на ИКБ не существует.

Ни для одной из реакций пока не приняты международные или национальные технические стандарты. Для эффективности серодиагностики ИКБ важнейшее значение имеет адекватность применяемого теста цели и задачам исследования. В ранней стадии заболевания (2-6 нед.) в практически улавливаемых количествах первыми появляются IgM-антитела. Однако они не обладают высокой специфичностью, и поэтому на этой стадии ИКБ диагностическое значение любой серологической реакции следует оценивать по наличию значимого (четырехкратного) нарастания титра антител.

На генерализованной стадии ИКБ возникают IgG-антитела. Их высокие титры на фоне возможного подъема IgM обычно позволяют на этом этапе заболевания, а также при рецидивах подтвердить диагноз даже при помощи наиболее простых серологических реакций (непрямая реакция флюоресценции, иммуноферментный метод). Иммунный ответ на поздней стадии заболевания характеризуется многообразием антител, причем их содержат около 80% сывороток. При нейроборрелиозе в большинстве случаев в спинномозговой жидкости присутствуют интратекальные антитела. Их выявление — важный лабораторно-диагностический критерий.

При массовом серо-эпидемиологическом обследовании принципиальное значение имеет не столько тип применяемой реакции, сколько правильный расчет скрининг-титра, позволяющий с заданной степенью достоверности судить о частоте контактов населения с возбудителями ИКБ и о показателях возможной хронизации этих заболеваний. В неясных случаях результат может быть уточнен при помощи иммуноблоттинга.

Один из наиболее распространенных серологических тестов — непрямая реакция иммунофлюоресценции (НРИФ): специфические антитела к возбудителям ИКБ или АКБ фиксируются корпускулярным антигеном (т.е. убитыми боррелиями), который светится при просмотре препарата в люминесцентном микроскопе благодаря добавлению сыворотки против всех иммуноглобулинов человека или иммуноглобулинов определенного класса, меченных флюоресцином. Иммуноферментная (энзим-меченых антител) реакция основана на том же принципе, но проводится в автоматическом режиме с очищенными сонификатами (взвесь боррелий, подвергнутая обработке ультразвуком), а антитела метят ферментом (щелочной фосфатазой или пероксидазой хрена); имеются стандартные коммерческие тест-системы для ИФЛ.

Разработана непрямая микромодификация иммуноферментной реакции на предметных стеклах (НМИФ), результат которой читают при помощи обычного светового микроскопа, причем она выполняется с таким же корпускулярным антигеном, что и НРИФ. Специфичность и чувствительность этих реакций по отношению к возбудителям боррелиозов принципиально не отличаются.

Ложноположительные результаты могут быть обусловлены перекрестными реакциями, например, с возбудителем сифилиса, белками теплового шока, герпес-вирусной инфекцией (особенно вызванной вирусом Эпштейна-Барра), ревматоидными и аутоиммунными заболеваниями.

Лучшие отечественные и зарубежные коммерческие стандартизованные ИФА-тест-системы на основе различных рекомбинантных антигенов (рекомбинантных протеинов I)bpA, VlsE и др.) или синтетических пептидов (например, производного от VlsE консервативного Сб-пептида) имеют достаточно высокую специфичность и чувствительность. В России такие тест-системы производят компании «Омникс» (Санкт-Петербург) и «Вектор-Вест» (Новосибирск).

Иммуноблоттинг, позволяющий выявлять специфические антитела к определенным белкам, обладает высокой специфичностью. Преимущество метода состоит в том, что он дает возможность получить данные об участии отдельных антигенов боррелий в формировании иммунного ответа на конкретной стадии инфекционного процесса. Однако критерии оценки результатов, которые получают в иммуноблоттинге на разных стадиях заболевания, не унифицированы, что подчас ставит под сомнение лабораторно-диагностические заключения, полученные этим методом.

Несмотря на все сложности самого адекватного подбора тестов и трактовки результатов на разных стадиях заболевания, серологическое исследование — это важнейший элемент клинико-диагностического обследования больного, особенно при отсутствии патогномоничного симптома, например, при безэритемной форме ИКБ. Однако при боррелиозах, как и при некоторых других спирохетозах, нередки серонегативные случаи заболевания, и их своевременная диагностика остается важной, пока еще нерешенной проблемой.

- Читать далее "Лечение и профилактика боррелий"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 10.2.2020