Взятие материала для диагностики инфекций вызванных грибами рода Candida

Стадии лабораторной диагностики включают микроскопию патологического материала или биоптата, выделение из материала чистой культуры возбудителя с его последующей идентификацией. Завершающим этапом исследования может стать определение чувствительности к антимикотическим препаратам.

Микроскопию грибов можно проводить с неокрашенными мазками. Для их приготовления на предметном стекле готовят мазок культуры в капле физиологического раствора, подсушивают, фиксируют на пламени или смесью спирта, воды и глицерина (1:1:1) и снова просушивают. Неокрашенные и нефиксированные препараты перед микроскопией желательно обработать 10-20 %-ным раствором гидроксида калия КОН. Неокрашенные и окрашенные мазки микроскопируют без иммерсии при увеличении: объектив х40, окуляр х7 или х10.

Для выделения из патологического материала, взятого от больного, штаммов, предположительно относящихся к роду Candida, было предложено в разные периоды несколько вариантов питательных сред, пригодных для этих целей. Одна из ранних питательных сред была предложена Раймбном Сабуро (Raymond Sabouraud) в 1896 и 1910 гг. для выделения дерматофитов. Позднее оказалось, что среда Сабуро широко и успешно используется и в настоящее время для выделения других видов патогенных грибов.

Поскольку некоторые виды рода Candida, особенно С. albicans, могут входить в состав нормальной флоры, при их выделении необходимо правильно использовать термин «колонизация». При выявлении грибов, как составной части микрофлоры (носительстве), колонизация означает, что при количественном посеве вырастает не более 102-103 колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл материала. Если показатель КОЕ/мл превышает эту величину, но признаки воспаления отсутствуют, то говорят о «повышенной колонизации». И, наконец, при наличии различных признаков воспаления слизистой оболочки или кожи и повышенном показателе КОЕ/мл, употребляется термин «инфекция» или кандидоз.

Подсчет числа колоний надо производить сразу через 48-72 час после посева и инкубации, иначе можно получить ложноположительные результаты.

Взятие и исследование материала из мест поражения больного грибами рода Candida

а) Кандидоз глотки и миндалин. При указанных локализациях чаще всего встречается псевдомембранозная форма кандидоза, реже хроническая его форма.

Взятие материала для исследования. При подозрении на псевдомембранозный кандидоз глотки и миндалин производят соскобы и смывы со слизистой полости рта, красной каймы и окружающей кожи, а также с зубных протезов (при их наличии у обследуемого). Налет со слизистой снимают ложечкой Фолькмана, стоматологическим скальпелем или петлей, а с эрозированных поверхностей можно собрать стерильным увлажненным тампоном (перед процедурой обследуемый должен прополоскать рот).

При необходимости проведения культурального исследования тампон следует поместить в транспортную среду или в бульон Сабуро.

Материал, подлежащий микроскопии: соскобы и смывы со слизистой полости рта, красной каймы и окружающих участков кожи.

Обработка мазков: обычно готовят неокрашенные мазки, фиксированные смесью спирта с глицерином, или же окрашенные по Граму. Положительным результатом считают обнаружение в одном или нескольких полях зрения более 10 бластоконидий, псевдогиф или истинных гиф. В случае хронической формы кандидоза, обусловленного штаммами С. albicans, наблюдают наличие мицелиальных форм.

С помощью культурального метода полученные результаты могут быть оценены количественно, что очень важно для подтверждения диагноза.

Суть метода: собранный тампоном материал переносят во флакон с 5 мл физиологического раствора и со стеклянными бусами и встряхивают в течение пяти минут. Затем 0,5 мл этой взвеси наносят на агар Сабуро с левомицетином в чашке Петри и равномерно растирают шпателем. Посевы инкубируют в течение 48 часов при температуре 37°С, после чего подсчитывают число выросших колоний и умножают его на 50. При этом получают данные, свидетельствующие о числе клеток Candida в смыве с 1 тампона в 1 мл среды (по числу колоний или колониеобразующих единиц — КОЕ). При наличии более 103 КОЕ/мл можно говорить о повышенной кандидозной колонизации.

б) Кандидоз бронхов и легких. Встречаются редко. Главным возбудителем при этих формах кандидоза является С. albicans. Другие представители рода Candida (С. glabrata, С. tropicalis и С. parapsilosis) редко вызывают кандидоз этих органов.

При сборе мокроты следует учитывать факт возможного загрязнения взятого образца грибами рода Candida, обитающими в полости рта и глотки. В связи с этим обследуемый, до взятия мокроты, должен прополоскать рот. Брать следует разовую утреннюю порцию мокроты перед первым приемом пищи. Рекомендуется также проводить исследование лаважной жидкости, а при подозрении на диссеминированный кандидоз — крови.

Наиболее ценным при этой патологии признается гистологическое исследование образца ткани, взятого при бронхоскопии.

Кандидоз бронхов и кандидозная бронхопневмония трудно диагносцируются из-за неспецифичности клинико-рентгенологических признаков. Выделение же грибов рода Candida из мокроты или лаважной жидкости, а также обнаружение почкующихся клеток гриба или псевдомицелия при микроскопии собранного материала могут лишь дополнительно подтверждать диагноз кандидоза, а положительный ответ, полученный при микроскопии, чаще всего может свидетельствовать лишь о колонизации грибами слизистой бронхов. К тому же, чувствительность метода бронхоскопии с последующим посевом лаважной жидкости составляет 60 %. Поэтому при исследовании мокроты и лаважной жидкости нецелесообразно проводить культуральное исследование, поскольку оно не подтверждает клинический диагноз.

Предпочтительнее — микроскопия, т.к. обнаружение при этом элементов мицелия или большого количества дрожжевых клеток может свидетельствовать не только о присутствии грибов рода Candida, но и о высокой степени колонизации, способной привести к заболеванию.

в) Кандидоз желудочно-кишечного тракта. Основной возбудитель — С. albicans, входящий в состав постоянной микрофлоры кишечника и обнаруживаемый в кале не менее чем у 70% населения. Другие виды Candida выделяются реже. Наличие в полости рта людей грибов Candida других видов может вызвать заболевание кандидным эзофагитом. Колонизацию пищевода и желудка можно предположить на основании колонизации полости рта человека грибами рода Candida. Первое место при этом занимает С. albicans, затем следуют С. tropicalis, С. kefyr, С. kmsei, С. parapsilosis и С. glabrata.

Кандидоз желудка и кишечника не имеет четких и общепризнанных диагностических критериев. Чаще всего он проявляется в виде диарейного синдрома, обусловленного грибами Candida, или в виде синдрома «раздраженной толстой кишки», выражающегося вздутием живота, болью в животе и, нередко, приступообразным водянистым стулом.

Кандидоз желудочно-кишечного тракта чаще всего — эндогенная инфекция. Экзогенное инфицирование начинается у новорожденных при прохождении через родовые пути.

Взятие материала для диагностики инфекций вызванных грибами рода Candida

Микроскопия. Для микроскопического исследования готовят мазки из следующих материалов:
• «слепые» смывы со слизистой пищевода;
• смывы со слизистой желудка;
• гастродуоденальный сок.

Положительный результат микроскопического исследования и выделение культуры из смывов пищевода имеет значение только при наличии клинических показателей. В случаях кандидоза любого отдела пищеварительного тракта результаты микроскопии предпочтительнее культурального исследования. Это связано с тем, что обнаружение при микроскопии элементов мицелия или большого количества дрожжевых клеток может свидетельствовать не только о присутствии грибов рода Candida, но и о значительной степени колонизации, способной привести к заболеванию.

г) Кандидоз почек и мочевыводящих путей. Наиболее частым грибом, выделяемым из мочи, является С. albicans, хотя при этом признается также роль и других видов Candida: С. glabrata, С. tropicalis, С. krusei и С. guilliermondii, вызывающих вместе от 10 до 30% случаев кандидоза.

При сборе мочи может иметь место контаминация грибами гениталий, а иногда и флорой катетера, используемого для сбора мочи. Перед сбором мочи его желательно удалить.

Признано, что обнаружение 104— 105 КОЕ/мл грибов Candida в моче при не катетеризованном мочевом пузыре может свидетельствовать о кандидозе почек.

Для выявления источника кандидурии рекомендовано орошать мочевой пузырь раствором амфотерицина В (50 мг/мл) в течение 5 дней. Если после этого кандидурия сохраняется, то ее источник надо искать в верхних отделах мочевого тракта.

Для диагноза кандидурии нецелесообразно использовать метод ПЦР даже в случае предрасположенности к инвазивному кандидозу.

Взятие материала для диагностики инфекций вызванных грибами рода Candida

д) Вагинальный кандидоз. Основным возбудителем вагинального кандидоза является С. albicans. Вторым по значимости возбудителем при этой форме кандидоза является С. glabrata (особенно на фоне сахарного диабета). Далее следуют: С. tropicalis, иногда С. krusei, С. parapsilosis.

Подозреваемые места поражения — слизистая влагалища. Материал, собираемый для исследования — соскобы со слизистой влагалища, вульвы, окружающей кожи взять с помощью стерильного тампона или стерильной петли. Взятие материала для исследования рекомендуется проводить с задней и боковой стенок влагалища или с переднего свода.

Микроскопия. Из полученного материала готовят мазки для прямой микроскопии и для цитологического исследования. Используют:
• неокрашенные препараты — при исследовании пленок, обработанных путем помещения в 10 %-ный раствор едкого кали;
• окрашенные по Граму, Романовскому-Гимзе или метиленовым синим.

Необходимо обращать внимание на наличие в мазках дрожжевых клеток или псевдомицелия (клетки гриба С. albicans не образуют псевдомицелия).

При микроскопии неокрашенных мазков выявляется четкая корреляция с симптомами вульво-вагинального кандидоза. За положительный результат микроскопии принимают превышение содержания грибов в материале более 103 КОЕ/мл (низкие показатели расцениваются, как нормальная колонизация). Рекомендуется определять pH среды влагалища (при кандидозе обычно pH близок к 4,5; при бактериальном вагинозе — выше 5,0).

Культуральный метод. Поскольку отмечаются случаи носительства грибов Candida (бессимптомная колонизация влагалища), необходимо использовать количественный культуральный метод для подтверждения диагноза.

Для этого собранный тампоном материал помещают во флакон с бусами, содержащий 5 мл физиологического раствора. Флакон встряхивают в течение 5 мин, после чего 0,5 мл взвеси стерильным шпателем равномерно распределяют по поверхности чашки Петри с агаром Сабуро с левомицетином. Подсчитывают выросшие колонии и умножают их число на 50, чтобы получить представление о количестве клеток гриба, содержащемся в смыве с 1 тампона в 1 мл среды (физиологического раствора). Число колоний выражают в КОЕ/мл. Незначительное количество выросших колоний свидетельствует о нормальном носительстве. В настоящее время заключение о повышенной колонизации или инфекции можно сделать при обнаружении более 104 КОЕ/мл.

Диагноз вагинального кандидоза подтверждается только при наличии клинических проявлений. В случае выделения более 104 КОЕ/мл Candida spp. и отсутствия клинических проявлений, можно говорить о бессимптомной колонизации. Количество выделенных грибов не коррелирует с выраженностью клинических проявлений.

Взятие материала для диагностики инфекций вызванных грибами рода Candida

е) Кандидоз кожи и ногтей. Главным возбудителем кандидоза кожи является С. albicans. К прочим возбудителям кандидоза кожи относят С. glabrata и С. tropicalis, иногда и другие виды.

Различают несколько проявлений кожного кандидоза:
• кандидоз крупных складок кожи;
• кандидоз межпальцевых складок;
• кандидоз кожи вне складок;
• кандидозный баланит и баланопостит;
• кандидозный фолликулит.

Главным возбудителем кандидозной паронихии и онихомикоза является С. albicans, вторым по частоте выделения — С. parapsilosis, хотя иногда он может оказаться и первым. Среди возбудителей онихомикозов на руках грибы рода Candida встречаются с равной или с более высокой частотой по сравнению с дерматофитами.

При кандидозном фолликулите преимущественно выделяют С. albicans.

При пеленочном дерматите, помимо С. albicans (наиболее часто ответственной за кандидоз складок у грудных детей), обнаруживают и другие виды: с пораженной кожи и из кала выделяют С. tropicalis, С. parapsilosis и С. kefyr.

Микроскопия. Из соскобов, взятых из пораженных кандидозом мест, готовят обычные неокрашенные и окрашенные по Граму мазки, а также цитологические мазки. Учитывают наличие дрожжевых клеток или псевдомицелия (что более предпочтительно для подтверждения диагноза).

В случае врожденного кандидоза предварительно поставленный клинический диагноз подтверждается только на основании гистологического исследования или микроскопии мазка.

Взятие материала для диагностики инфекций вызванных грибами рода Candida

ж) Диссеминированный кандидоз. При диссеминированном кандидозе имеют место экзогенные источники инфекции (особенно в условиях стационара). Главным возбудителем является С. albicans, далее по частоте встречаемости следуют С. parapsilosis, С. glabrata и С. guilliermondii. При этом отмечают также неодинаковую чувствительность возбудителя к антимикотикам: устойчивыми чаще всего являются С. glabrata, С. kmsei, С. lusitaniae, а менее чувствительными — С. tropicalis и С. parapsilosis.

Диссеминированный кандидоз довольно часто развивается как эндогенная инфекция у больных с лейкозами и лимфомами, реже при других онкологических заболеваниях, а также у больных, получавших цитостатики (от 10 до 30% случаев).

Выделение возбудителя. Производят посевы крови на специальные среды для гемокультур. Возбудителя кандидоза можно выделить из крови и стерильных жидкостей лишь в 20-75% случаев. Трудно выделить возбудителя из крови больных при наличии у них хронического диссеминированного кандидоза. При этой форме канндидоза рекомендуется видовая идентификация возбудителя, поскольку зачастую она обусловлена редкими видами грибов Candida с неясной чувствительностью к антимикотикам.

- Читать далее "Методы идентификации выделенных грибов на микроморфологическом уровне"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 8.5.2020

Остались вопросы или замечания?

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.