Стадии лабораторной диагностики включают микроскопию патологического материала или биоптата, выделение из материала чистой культуры возбудителя с его последующей идентификацией. Завершающим этапом исследования может стать определение чувствительности к антимикотическим препаратам.

Микроскопию грибов можно проводить с неокрашенными мазками. Для их приготовления на предметном стекле готовят мазок культуры в капле физиологического раствора, подсушивают, фиксируют на пламени или смесью спирта, воды и глицерина (1:1:1) и снова просушивают. Неокрашенные и нефиксированные препараты перед микроскопией желательно обработать 10-20 %-ным раствором гидроксида калия КОН. Неокрашенные и окрашенные мазки микроскопируют без иммерсии при увеличении: объектив х40, окуляр х7 или х10.

Для выделения из патологического материала, взятого от больного, штаммов, предположительно относящихся к роду Candida, было предложено в разные периоды несколько вариантов питательных сред, пригодных для этих целей. Одна из ранних питательных сред была предложена Раймбном Сабуро (Raymond Sabouraud) в 1896 и 1910 гг. для выделения дерматофитов. Позднее оказалось, что среда Сабуро широко и успешно используется и в настоящее время для выделения других видов патогенных грибов.

Поскольку некоторые виды рода Candida, особенно С. albicans, могут входить в состав нормальной флоры, при их выделении необходимо правильно использовать термин «колонизация». При выявлении грибов, как составной части микрофлоры (носительстве), колонизация означает, что при количественном посеве вырастает не более 10²-10³ колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл материала. Если показатель КОЕ/мл превышает эту величину, но признаки воспаления отсутствуют, то говорят о «повышенной колонизации». И, наконец, при наличии различных признаков воспаления слизистой оболочки или кожи и повышенном показателе КОЕ/мл, употребляется термин «инфекция» или кандидоз.

Подсчет числа колоний надо производить сразу через 48-72 час после посева и инкубации, иначе можно получить ложноположительные результаты.

Взятие и исследование материала из мест поражения больного грибами рода Candida

а) Кандидоз глотки и миндалин. При указанных локализациях чаще всего встречается псевдомембранозная форма кандидоза, реже хроническая его форма.

Взятие материала для исследования. При подозрении на псевдомембранозный кандидоз глотки и миндалин производят соскобы и смывы со слизистой полости рта, красной каймы и окружающей кожи, а также с зубных протезов (при их наличии у обследуемого). Налет со слизистой снимают ложечкой Фолькмана, стоматологическим скальпелем или петлей, а с эрозированных поверхностей можно собрать стерильным увлажненным тампоном (перед процедурой обследуемый должен прополоскать рот).

При необходимости проведения культурального исследования тампон следует поместить в транспортную среду или в бульон Сабуро.

Материал, подлежащий микроскопии: соскобы и смывы со слизистой полости рта, красной каймы и окружающих участков кожи.

Обработка мазков: обычно готовят неокрашенные мазки, фиксированные смесью спирта с глицерином, или же окрашенные по Граму. Положительным результатом считают обнаружение в одном или нескольких полях зрения более 10 бластоконидий, псевдогиф или истинных гиф. В случае хронической формы кандидоза, обусловленного штаммами С. albicans, наблюдают наличие мицелиальных форм.

С помощью культурального метода полученные результаты могут быть оценены количественно, что очень важно для подтверждения диагноза.

Суть метода: собранный тампоном материал переносят во флакон с 5 мл физиологического раствора и со стеклянными бусами и встряхивают в течение пяти минут. Затем 0,5 мл этой взвеси наносят на агар Сабуро с левомицетином в чашке Петри и равномерно растирают шпателем. Посевы инкубируют в течение 48 часов при температуре 37°С, после чего подсчитывают число выросших колоний и умножают его на 50. При этом получают данные, свидетельствующие о числе клеток Candida в смыве с 1 тампона в 1 мл среды (по числу колоний или колониеобразующих единиц — КОЕ). При наличии более 10³ КОЕ/мл можно говорить о повышенной кандидозной колонизации.

б) Кандидоз бронхов и легких. Встречаются редко. Главным возбудителем при этих формах кандидоза является С. albicans. Другие представители рода Candida (С. glabrata, С. tropicalis и С. parapsilosis) редко вызывают кандидоз этих органов.

При сборе мокроты следует учитывать факт возможного загрязнения взятого образца грибами рода Candida, обитающими в полости рта и глотки. В связи с этим обследуемый, до взятия мокроты, должен прополоскать рот. Брать следует разовую утреннюю порцию мокроты перед первым приемом пищи. Рекомендуется также проводить исследование лаважной жидкости, а при подозрении на диссеминированный кандидоз — крови.

Наиболее ценным при этой патологии признается гистологическое исследование образца ткани, взятого при бронхоскопии.

Кандидоз бронхов и кандидозная бронхопневмония трудно диагносцируются из-за неспецифичности клинико-рентгенологических признаков. Выделение же грибов рода Candida из мокроты или лаважной жидкости, а также обнаружение почкующихся клеток гриба или псевдомицелия при микроскопии собранного материала могут лишь дополнительно подтверждать диагноз кандидоза, а положительный ответ, полученный при микроскопии, чаще всего может свидетельствовать лишь о колонизации грибами слизистой бронхов. К тому же, чувствительность метода бронхоскопии с последующим посевом лаважной жидкости составляет 60 %. Поэтому при исследовании мокроты и лаважной жидкости нецелесообразно проводить культуральное исследование, поскольку оно не подтверждает клинический диагноз.

Предпочтительнее — микроскопия, т.к. обнаружение при этом элементов мицелия или большого количества дрожжевых клеток может свидетельствовать не только о присутствии грибов рода Candida, но и о высокой степени колонизации, способной привести к заболеванию.

в) Кандидоз желудочно-кишечного тракта. Основной возбудитель — С. albicans, входящий в состав постоянной микрофлоры кишечника и обнаруживаемый в кале не менее чем у 70% населения. Другие виды Candida выделяются реже. Наличие в полости рта людей грибов Candida других видов может вызвать заболевание кандидным эзофагитом. Колонизацию пищевода и желудка можно предположить на основании колонизации полости рта человека грибами рода Candida. Первое место при этом занимает С. albicans, затем следуют С. tropicalis, С. kefyr, С. kmsei, С. parapsilosis и С. glabrata.

Кандидоз желудка и кишечника не имеет четких и общепризнанных диагностических критериев. Чаще всего он проявляется в виде диарейного синдрома, обусловленного грибами Candida, или в виде синдрома «раздраженной толстой кишки», выражающегося вздутием живота, болью в животе и, нередко, приступообразным водянистым стулом.

Кандидоз желудочно-кишечного тракта чаще всего — эндогенная инфекция. Экзогенное инфицирование начинается у новорожденных при прохождении через родовые пути.

Микроскопия. Для микроскопического исследования готовят мазки из следующих материалов:
• «слепые» смывы со слизистой пищевода;
• смывы со слизистой желудка;
• гастродуоденальный сок.

Положительный результат микроскопического исследования и выделение культуры из смывов пищевода имеет значение только при наличии клинических показателей. В случаях кандидоза любого отдела пищеварительного тракта результаты микроскопии предпочтительнее культурального исследования. Это связано с тем, что обнаружение при микроскопии элементов мицелия или большого количества дрожжевых клеток может свидетельствовать не только о присутствии грибов рода Candida, но и о значительной степени колонизации, способной привести к заболеванию.

г) Кандидоз почек и мочевыводящих путей. Наиболее частым грибом, выделяемым из мочи, является С. albicans, хотя при этом признается также роль и других видов Candida: С. glabrata, С. tropicalis, С. krusei и С. guilliermondii, вызывающих вместе от 10 до 30% случаев кандидоза.

При сборе мочи может иметь место контаминация грибами гениталий, а иногда и флорой катетера, используемого для сбора мочи. Перед сбором мочи его желательно удалить.

Признано, что обнаружение 10⁴— 10⁵ КОЕ/мл грибов Candida в моче при не катетеризованном мочевом пузыре может свидетельствовать о кандидозе почек.

Для выявления источника кандидурии рекомендовано орошать мочевой пузырь раствором амфотерицина В (50 мг/мл) в течение 5 дней. Если после этого кандидурия сохраняется, то ее источник надо искать в верхних отделах мочевого тракта.

Для диагноза кандидурии нецелесообразно использовать метод ПЦР даже в случае предрасположенности к инвазивному кандидозу.

д) Вагинальный кандидоз. Основным возбудителем вагинального кандидоза является С. albicans. Вторым по значимости возбудителем при этой форме кандидоза является С. glabrata (особенно на фоне сахарного диабета). Далее следуют: С. tropicalis, иногда С. krusei, С. parapsilosis.

Подозреваемые места поражения — слизистая влагалища. Материал, собираемый для исследования — соскобы со слизистой влагалища, вульвы, окружающей кожи взять с помощью стерильного тампона или стерильной петли. Взятие материала для исследования рекомендуется проводить с задней и боковой стенок влагалища или с переднего свода.

Микроскопия. Из полученного материала готовят мазки для прямой микроскопии и для цитологического исследования. Используют:
• неокрашенные препараты — при исследовании пленок, обработанных путем помещения в 10 %-ный раствор едкого кали;
• окрашенные по Граму, Романовскому-Гимзе или метиленовым синим.

Необходимо обращать внимание на наличие в мазках дрожжевых клеток или псевдомицелия (клетки гриба С. albicans не образуют псевдомицелия).

При микроскопии неокрашенных мазков выявляется четкая корреляция с симптомами вульво-вагинального кандидоза. За положительный результат микроскопии принимают превышение содержания грибов в материале более 10³ КОЕ/мл (низкие показатели расцениваются, как нормальная колонизация). Рекомендуется определять pH среды влагалища (при кандидозе обычно pH близок к 4,5; при бактериальном вагинозе — выше 5,0).

Культуральный метод. Поскольку отмечаются случаи носительства грибов Candida (бессимптомная колонизация влагалища), необходимо использовать количественный культуральный метод для подтверждения диагноза.

Для этого собранный тампоном материал помещают во флакон с бусами, содержащий 5 мл физиологического раствора. Флакон встряхивают в течение 5 мин, после чего 0,5 мл взвеси стерильным шпателем равномерно распределяют по поверхности чашки Петри с агаром Сабуро с левомицетином. Подсчитывают выросшие колонии и умножают их число на 50, чтобы получить представление о количестве клеток гриба, содержащемся в смыве с 1 тампона в 1 мл среды (физиологического раствора). Число колоний выражают в КОЕ/мл. Незначительное количество выросших колоний свидетельствует о нормальном носительстве. В настоящее время заключение о повышенной колонизации или инфекции можно сделать при обнаружении более 10⁴ КОЕ/мл.

Диагноз вагинального кандидоза подтверждается только при наличии клинических проявлений. В случае выделения более 10⁴ КОЕ/мл Candida spp. и отсутствия клинических проявлений, можно говорить о бессимптомной колонизации. Количество выделенных грибов не коррелирует с выраженностью клинических проявлений.

е) Кандидоз кожи и ногтей. Главным возбудителем кандидоза кожи является С. albicans. К прочим возбудителям кандидоза кожи относят С. glabrata и С. tropicalis, иногда и другие виды.

Различают несколько проявлений кожного кандидоза:
• кандидоз крупных складок кожи;
• кандидоз межпальцевых складок;
• кандидоз кожи вне складок;
• кандидозный баланит и баланопостит;
• кандидозный фолликулит.

Главным возбудителем кандидозной паронихии и онихомикоза является С. albicans, вторым по частоте выделения — С. parapsilosis, хотя иногда он может оказаться и первым. Среди возбудителей онихомикозов на руках грибы рода Candida встречаются с равной или с более высокой частотой по сравнению с дерматофитами.

При кандидозном фолликулите преимущественно выделяют С. albicans.

При пеленочном дерматите, помимо С. albicans (наиболее часто ответственной за кандидоз складок у грудных детей), обнаруживают и другие виды: с пораженной кожи и из кала выделяют С. tropicalis, С. parapsilosis и С. kefyr.

Микроскопия. Из соскобов, взятых из пораженных кандидозом мест, готовят обычные неокрашенные и окрашенные по Граму мазки, а также цитологические мазки. Учитывают наличие дрожжевых клеток или псевдомицелия (что более предпочтительно для подтверждения диагноза).

В случае врожденного кандидоза предварительно поставленный клинический диагноз подтверждается только на основании гистологического исследования или микроскопии мазка.

ж) Диссеминированный кандидоз. При диссеминированном кандидозе имеют место экзогенные источники инфекции (особенно в условиях стационара). Главным возбудителем является С. albicans, далее по частоте встречаемости следуют С. parapsilosis, С. glabrata и С. guilliermondii. При этом отмечают также неодинаковую чувствительность возбудителя к антимикотикам: устойчивыми чаще всего являются С. glabrata, С. kmsei, С. lusitaniae, а менее чувствительными — С. tropicalis и С. parapsilosis.

Диссеминированный кандидоз довольно часто развивается как эндогенная инфекция у больных с лейкозами и лимфомами, реже при других онкологических заболеваниях, а также у больных, получавших цитостатики (от 10 до 30% случаев).

Выделение возбудителя. Производят посевы крови на специальные среды для гемокультур. Возбудителя кандидоза можно выделить из крови и стерильных жидкостей лишь в 20-75% случаев. Трудно выделить возбудителя из крови больных при наличии у них хронического диссеминированного кандидоза. При этой форме канндидоза рекомендуется видовая идентификация возбудителя, поскольку зачастую она обусловлена редкими видами грибов Candida с неясной чувствительностью к антимикотикам.

- Читать далее "Методы идентификации выделенных грибов на микроморфологическом уровне"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 8.5.2020