Методы идентификации выделенных грибов на микроморфологическом уровне

В последние годы в большинстве бактериологических лабораторий для обнаружения грибов в исследуемом материале используют агар Сабуро с хлорамфениколом или без него, когда нет необходимости подавления сопутствующей микрофлоры. Однако видовая идентификация грибов на этих средах создает определенные проблемы. Это связано с тем, что при выращивании представителей рода Candida в течение 24-48 часов на средах Сабуро штаммы грибов обнаруживаются только в дрожжеподобных формах. При микроскопии они выглядят одинаково, как округлые или слегка вытянутые почкующиеся клетки. Поэтому не представляется возможным идентифицировать их на микроморфологическом уровне.

Штаммы С. albicans являются единственным видом, принадлежность к которому может быть идентифицирована на основании выявления достаточно простого морфологического признака — образования хламидоконидий (хламидоспор). Эти образования могут быть концевыми или боковыми, круглыми или овальными, диаметром от 6 до 12 мкм, с толстой стенкой, отличающимися от спор других грибов, имеющих диаметр от 3 до 4 мкм.

С целью стимуляции образования специфических репродуктивных структур — хламидоконидий (хламидоспор) или элементов псевдо- или истиного мицелия, применяют среды, бедные питательными веществами. Наиболее распространенными средами являются картофельно-морковный агар с желчью (РСВ — potato-carrotebile, англ.), кукурузный агар и рисовый агар с Твином-80.

Остановимся на методах, которые при использовании указанных сред позволяют в определенной степени определить некоторые микроморфологические характеристики грибов рода Candida.

Методы идентификации выделенных грибов на микроморфологическом уровне
Схема посева штамма Candida spp. на чашки Петри с кукурузным агаром по методу Дальмау.

РСВ-среда (каргофельно-морковно-желчный агар). При культивировании на этой среде штаммов Candida, морфологические особенности филаментов позволяют идентифицировать их до вида. Многие микологи мира для идентификации грибов рода Candida предпочитают использовать кукурузный агар, с помощью которого исследуют микроморфологические признаки грибов этого рода, применяя метод, предложенный G. I. Dalmau.

Суть метода Дальмау сводится к следующему: стерильной деревянной палочкой (можно зубочисткой) наносят чистую суспензию 24-часовой культуры тест-гриба в чашку на кукурузный агар, проводя два близко расположенных штриха длиной примерно 2 см. Затем участок посева накрывают стерильным покровным стеклом и инкубируют чашку при комнатной температуре в течение 48 ч. После 48-часовой инкубации культуру тест-гриба прямо в чашке микроскопируют при увеличении х200 — х400, обращая при этом внимание на образование псевдогиф, истинных гиф, артроконидий или бластоконидий.

С помощью этого метода удалось очень четко определить микроморфологическую структуру различных представителей рода Candida.

Для этого используют следующую схему определения:

1-й день: материал, отобранный из различных клинических источников (ран, ожогов, разных нестерильных локусов, мочи, мокроты, кала, экссудатов) и других источников, в том числе взятых с различных предметов окружающей среды, засевают на среду Сабуро с глюкозой и левомицетином и выращивают в термостате при 36-37°С в течение 48 ч. Затем, отобрав отдельные, типичные для грибов этого рода колонии, их суспендируют в физиологическом растворе и полученную суспензию наносят на агаровую среду с кукурузным настоем по схеме, предложенной Дальмау.

Через 48 часов рост тест-культуры гриба микроскопируют прямо в чашке при увеличении х200 — х400, тщательно просматривая полученный материал.

С помощью этого метода известным исследователям микологам Д. Саттон, А. Фотергилл, М. Ринальди удалось очень четко описать микроморфологическую структуру различных представителей рода Candida в книге «Определение патогенных и условно-патогенных грибов».

Методы идентификации выделенных грибов на микроморфологическом уровне
Настоящие (истинные) гифы, бластоконидии и хламидоконидии на кукурузном агаре в чашках Петри. Ув. х 460.

На изображенных в книге фотоснимках можно видеть, что у выращенных на кукурузном агаре по методу Дальмау различных видов Candida очень четко выявляется их микроморфологическая структура. Так, на фотоснимках, изображающих морфологическую структуру штамма С. albicans, хорошо видны истинные гифы и бластоконидии.

Истинные гифы характерны только для С. albicans, отличаются от псевдогиф отсутствием сужений в области септ (перегородок). Культуры С. albicans образуют крупные толстостенные хламидоконидии на концах истинных гиф или по ходу псевдогиф. Структуры, подобные хламидоконидиям, но с более тонкими стенками, имеются у С. tropicalis.

Бластоконидии (собственно дрожжевые клетки) — структуры бесполого размножения всех дрожжевых грибов. Они возникают при почковании и имеют вид небольших круглых клеток, а при их удлинении образуют псевдогифы.

На рисунках, сделанных соответственно с микрофотографий грибов С. kefyr, С. krusei и С. guilliermondii, хорошо видны псевдогифы различной формы. Псевдогифы выглядят как нити, суженные в области перемычек (септ). Наличие псевдогиф — неспецифический признак, однако их размеры, форма, расположение в сочетании с другими морфологическими признаками могут способствовать определению гриба до вида, а также подтверждать принадлежность его к роду Candida.

На рисунке выше представлены размеры клеток С. glabrata (А) по сравнению с грибом другого рода, Cryptococcus neoformans (Б). С. glabrata является гаплоидным организмом и поэтому не способна образовывать мицелиальные структуры.

Методы идентификации выделенных грибов на микроморфологическом уровне
Псевдогифы С. kefyr. (А), С. krusei (Б) и С. guilliermondii (В).

Представленная на этих рисунках и фотоснимках микроморфологическая структура грибов рода Candida свидетельствует о том, что при использовании сред РСВ и кукурузного агара только один представитель рода Candida (С. albicans) может быть сразу идентифицирован на основании его микроморфологической структуры (образование истинного мицелия и ростовой трубки).

Используя тест образования ростовых (герминантных, проростковых или зародышевых) трубок, можно получить некоторые видовые характеристики представителей рода Candida через 2-3 часа. Метод простой в исполнении и очень быстрый. Тест можно проводить только в случае, если дрожжевые грибы выделены в чистой культуре.

Суть теста сводится к следующему: колонию 24-часовой культуры дрожжевого гриба вносят в пробирку с 0,5-1,0 мл стерильной сыворотки крови и выдерживают в течение 2-3 часов при 37°С. Можно использовать сыворотку или плазму животных, человеческую, а также и искусственные среды (например, бульон с сердечномозговой вытяжкой).

После 2-3 часовой инкубации проб в термостате, каплю содержимого пробирки помещают на предметное стекло, покрывают покровным и исследуют под микроскопом при увеличении х400. В этом случае можно видеть образование дрожжевыми клетками филаментов — ростовых трубок. Последние являются предшественниками (зародышами) истинных гиф, которые могут образовываться только грибами вида С. albicans. Для истинных ростовых трубок, образуемых С. albicans, характерно отсутствие сужения в основании трубки, там, где она образуется из материнской клетки.

Методы идентификации выделенных грибов на микроморфологическом уровне
Размеры клетки С. glabrata (А) по сравнению с С. neoformans (Б). Ув. х 920.

Таким образом, по результату этого теста можно предположительно идентифицировать культуру гриба как С. albicans или исключить таковую возможность. К образованию истинных трубок способен также вид С. stellatoidea (сейчас микологи относят его к биовару С. albicans.)

При обнаружении в культурах неснецифических признаков, к примеру, бластоконидий и псевдогиф, прибегают к использованию дополнительных тестов. Важными тестами дополнительного скрининга грибов рода Candida являются: рост на агаре Сабуро с циклогексимидом, на агаре Сабуро с 2,3,5-трифенилтетразолиум хлоридом, определение ассимиляции и ферментации углеводов и др..

- Читать далее "Изучение грибов рода Candida на макроскопическом уровне"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 8.5.2020

Остались вопросы или замечания?

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.