Микробиологическая диагностика возбудителя листериоза

В связи с многообразием форм и проявлений листериоза постановка диагноза болезни не может основываться только на данных клинической симптоматологии. При обследовании больного с подозрением на листериоз большое значение имеют результаты эпидемиологического анамнеза (производственная деятельность, бытовые условия). Однако даже клинический симптомокомплекс с данными эпидемиологического анамнеза позволяют поставить лишь предварительный диагноз. Окончательный диагноз может быть верифицирован только после проведения бактериологического анализа и выделения L. monocytogenes из клинического материала.

Бактериологическое исследование клинического материала при выделении листерий выполняется в двух вариантах:

1) выделение листерий из стерильных биологических жидкостей: ликвора, крови, синовиальной, плевральной, перикардиальной и амниотической жидкостей;

2) выделение листерий из нестерильного клинического материала: носоглоточной слизи, отделяемого нагноившихся фликтен кожных покровов, гнойного отделяемого конъюнктивы при поражении глаз, фекалий, мекония и отделяемого половых органов у рожениц.

Следует учитывать, что для роста листерий и появления изменений дифференциально-диагностических сред требуется иногда нескольких суток. Поэтому в схеме бактериологического исследования на листериоз порядковый номер дня начиная со второго не всегда соответствует очередным 24 часам, иногда интервалы между днями исследования затягиваются до 48-96 ч.

а) Схема выделения листерий из стерильного клинического материала. Первым этапом исследования материала на листериоз является прямая бактериоскопия окрашенных препаратов-мазков. При положительном результате окраски по Граму в ликворе, синовиальной и плевральной жидкости обнаруживаются мелкие единичные грамположительные палочки с закругленными концами, расположенные хаотично, иногда под углом друг к другу в виде римской цифры V. В некоторых случаях палочки настолько мелкие, что напоминают кокки, что дает повод для ошибочного заключения о выделении пневмококка или энтерококка, в других случаях палочки имеют на концах или в середине утолщения, и тогда возникает вопрос о возможности обнаружения в исследуемом материале коринебактерий.

1. В мазках крови, окрашенных методом Романовского-Гимзы, встречаются единичные листерии, расположенные между форменными элементами в виде коротких палочек, коккобактерий или бактерий, сходных с коринебактериями, красно-фиолетового цвета. Положительный результат бактериоскопии материала позволяет дать ориентировочный ответ.

Для бактериологического исследования на листериоз крови, ликвора, плевральной и синовиальной жидкостей используются жидкие и плотные элективные среды. Из жидких сред рекомендуются: тиогликолевая среда и дрожжевой триптон-соевый бульон с глюкозой как среды обогащения. Из плотных питательных сред: мясопептонный агар с добавлением 5% бараньей крови, за исключением посевов ликвора.

2. Кровь. Первый день. Учитывая бактерицидные свойства крови, ее засевают в жидкую питательную среду в соотношении 1:9. Для посева желательно использовать 5-10 мл крови, поэтому для выделения гемокультур пользуются не пробирками, а флаконами. Посевы инкубируют 24-48 ч при температуре 37°С. При отрицательном результате посев крови оставляют на 10-14 сут., периодически делая из него высевы на плотные среды.

3. Жидкости, полученные из стерильных полостей, в большом количестве высевают в жидкую питательную среду в соотношении 1:9, так же как кровь для выделения гемокультуры. Посевы инкубируют до появления заметного помутнения или опалесценции среды в течение нескольких суток при 37°С, делая первый высев на плотную среду через 24-48 ч.

4. Ликвор. Первый день. Доставленный в лабораторию ликвор в упаковке, поддерживающей температуру 37°С, немедленно подвергают бактериологическому анализу. Чашки с посевами материал;» инкубируют при 37°С в течении 48 ч. При отсутствии роста через 48 ч, посевы выдерживают в термостате до 5-7 сут.

Второй день. Учитываются результаты посевов на жидкие питательные среды. Если признаков роста не обнаруживается, посевы оставляют еще на одни сутки. При наличии признаков микробного роста (легкое помутнение или опалесценция среды) производят высев на МПА с 5% овечьей, кроличьей, лошадиной или человеческой (без консервантов) крови. Высев с жидкой питательной среды желательно делать на 2 чашки кровяного агара: для посева шпателем и бактериологической петлей, двумя истощающими штрихами, нанесенными перпендикулярно друг другу, с целью получения изолированных колоний. Чашки с засеянным кровяным агаром помещают в термостат при температуре 37"С на 48 ч.

Третий день. Учитывают рост бактерий на поверхности кровяного агара, засеянного в первый день из сред обогащения. Для работы используют чашку с ростом изолированных колоний. Из типичных для L.monocytogenes колоний делают мазки для окрашивания их по Граму и микроскопии. При соответствии микроскопической картины описанной выше морфологии листерий выделенную культуру используют для дальнейшей работы. Делают высев в 2-3 пробирки со скошенным 20% сывороточным или кровяным либо дрожжевым триптон-соевым агаром для накопления чистой культуры листерий, необходимой для идентификации выделенного микроорганизма. «Косяки» с посевами культуры инкубируют в термостате при 37°С в течение 48 ч.

На четвертый день приступают к идентификации культуры L.monocytogenes. Определяют каталазную активность выделенной культуры. Каталазообразование характерно не только для всех видов Listeria, но и для коринебактерий. Однако все коринебактерии, в отличие от листерий, неподвижны.

После ориентировочного определения принадлежности выделенных культур к роду Listeria, приступают к определению их видовой принадлежности. Выделенную культуру проверяют на ферментацию трех углеводов: маннита, ксилозы и рамнозы. Для определения ферментации углеводов используют среды Гиса или среды с бромкремзоловым пурпурным. Пробирки с посевами для ферментации углеводов помещают в термостат при 36°С и ведут за ними наблюдение в течение 7 сут., ежедневно проверяя кислото- и газообразование, хотя ферментация рамнозы выявляется обычно уже на вторые сутки роста.

Определение лецитиназы (фосфатидилхолинспецифичной фосфолипазы) производят на агаризированной среде ГРМ № 1 в двух чашках Петри с 0,5% активированным углем и без него. Исследуемые штаммы высевают короткими штрихами на обе чашки и инкубируют 48 ч при температуре 37°С.

Испытуемые штаммы проверяют повторно на гемолитическую активность. С этой целью используют агар с 5% овечьей или, реже, лошадиной крови и 1% глюкозы. Исследуемый штамм засевают уколом в кровяной агар.

Из типичных для L. monocytogenes колоний, снятых с чашки кровяного агара, ставят пробу на подвижность выделенного микроорганизма. Для этого засевают уколом бактериологической петли две пробирки с полужидкими средами для определения подвижности. Одну из засеянных пробирок оставляют на 24 ч при комнатной температуре 20-22"С, вторую инкубируют в термостате при 37°С.

Культуры, выросшие при низкой температуре (не выше 22°С), отличаются большой подвижностью, что выражается спецификой роста в форме зонтика на поверхности столбика среды.

При температуре выше 30°С листерии утрачивают свои немногочисленные жгутики и вместе с ними способность к подвижности. Неподвижные культуры растут в виде тонкого штриха по ходу укола бактериологической петли и только вверху, на 2-3 мм ниже поверхности среды, отмечается более обширная зона интенсивного роста, свидетельствующая о принадлежности листерий к категории факультативно анаэробных бактерий.

Пятый день. Просматривают посевы на средах для учета ферментации углеводов, фиксируя признаки ферментации маннита, ксилозы и рамнозы. Ферментация рамнозы L.monocytogenes определяется обычно уже на вторые сутки. Учитывают появление лецитиназы на чашках ГРМ №1 с активированным углем и без него. Лецитиназная активность штаммов, проявляющаяся образованием плотной зоны помутнения шириной в 2 мм через сутки и 6-8 мм — через 2 сут. роста, обнаруживается у L.monocytogenes только на среде ГРМ № 1 с активированным углем.

Учитывают β-гемолитическую активность листерий, засеянных уколом вглубь кровяного агара. Культуры L.monocytogenes образуют вокруг места укола узкие зоны гемолиза.

Учитывают результаты пробы на подвижность.

5. Исследование ликвора при подозрении на менингит имеет ряд особенностей. По клиническими признакам листериозный менингит не отличается от гнойных менингитов, вызываемых (чаще, чем листериями) менингококками, пневмококками, гемофилами и рядом условно патогенных микроорганизмов. Поэтому при получении ликвора для исследования, учитывая тяжесть заболевания, врач должен быть готов к выделению всех потенциальных возбудителей гнойного менингита.

Первый день. Предварительную микроскопию ликвора с целью экономии образца и защиты его от возможной контаминации производят не всегда. Для микроскопии препараты-мазки готовят только из осадка, если он имеется (или образовался в результате центрифугирования образца), причем делают это только после проведения посевов.

Опалесцирующий или прозрачный ликвор желательно центрифугировать и для посевов использовать осадок.

Вначале засевают (по 1-3 капле пипеткой) 3 чашки Петри с агаром: «шоколаднокровяным», чтобы уловить Н. influenzae, 20% сывороточным — для менингококка, пневмококка и листерий и обычным МПА. Чашки культивируют при повышенном содержании CO₂. Оставшиеся 2-3 мл ликвора (кроме осадка) засевают в пробирку с 5,0 мл полужидкого питательного агара или тиогликолевую среду для обогащения; посевы помещают в термостат.

Из осадка готовят 2 мазка на стекле, их окрашивают 1% водным раствором метиленового синего и по Граму. На основании бактериоскопии, в случае обнаружения микроорганизмов, выдается предварительный ориентировочный ответ.

Второй день. Через 24-48 ч просматривают посевы на агаровых средах. Отмечают характерный рост, внешний вид колоний; из колоний готовят препараты-мазки, окрашенные по Граму. Листерии вырастают на всех трех средах, однако на агаре с кровью и сывороткой колонии более развитые (1,0-1,5 мм в диаметре, выпуклые, бело-сероватые), чем на простом МПА.

При подозрении на листерии делают отсев нескольких колоний в пробирки с кровяным или сывороточным скошенным агаром.

В этот же день можно сделать (при появлении признаков роста) высев из сред обогащения на 3 чашки с агаровыми средами, используемыми для первичного прямого посева ликвора.

Третий день. Изучают культуры, выросшие в пробирках при отсеве в предыдущий день по той же схеме, что и культуры, выделенные из крови и синовиальной жидкости.

б) Схема выделения листерий из нестерильного клинического материала. Наряду со стерильными биологическими жидкостями в лабораторию для микробиологической диагностики листериоза поступает отделяемое миндалин и ротоглотки, гной вскрывшихся абсцессов, отделяемое половых путей женщин, испражнения. Каждый из перечисленных образцов клинического материала, помимо предполагаемого возбудителя, содержит специфическую для него грамположительную и грамотрицательную бактериальную микрофлору а в ряде случаев и грибы.

Количество листерий в этих образцах на общем микробном фоне невелико, скорость их роста уступает резистентным условно-патогенным бактериям, поэтому для успешного проведения анализа прибегают к использованию селективных питательных сред.

В качестве селективных агентов для выделения листерий используется широкий спектр химических соединений, в том числе солей и антибиотиков. Основными селективными реагентами являются теллурит калия, налидиксовая кислота, акрифлавин, лития хлорид, антибиотики (цефтазидим, полимиксин В, колистин, цефотетан, цик-логексимид, фосфомидин).

Схема выделения листерий из клинического материала, контаминированного сопутствующей микрофлорой, включает следующие этапы.

Первый день. Поступивший на исследование клинический материал высевают параллельно на селективные плотные и жидкие питательные среды.

Для прямого посева материала используют плотные среды, являющиеся одновременно селективными, и дифференциально-диагностическими. Наиболее рекомендуемыми считаются сухие агаровые среды с селективными добавками — среды ПАЛ, PALCAM и Оксфордская среда. В среде PALCAM, наряду с источниками углерода и азота (пептон, глюкоза и др.), содержатся лития хлорид, полимиксин В, цефтазидим и акрифлавина гидрохлорид в качестве селективных агентов, подавляющих сопутствующую флору, а также две индикаторные системы. Одна из них — маннит и феноловый красный (L.monocytogenes не ферментирует маннит, в отличие многих видов кокков сопутствующей флоры), вторая — эскулин и цитрат аммонийного железа.

Листерии разлагают эскулин с образованием эскулетина, который образует с железом комплекс коричневого цвета. Незасеянная среда прозрачна, окрашена в красный цвет.

Другие плотные среды, рекомендуемые для выделения и одновременной дифференциации листерий, — среда ПАЛ и Оксфордский агар. В качестве селективных агентов используют антибиотики, лития хлорид, циклогексимид, фосфомидин для подавления грамотрицательной флоры. В качестве индикаторной системы используется эскулин и железа аммонийного цитрат.

Отделяемое миндалин и ротоглотки, так же как и отделяемое женских половых путей и глаз, взятое на тампоны, высевают на три чашки со средой. На поверхность среды первой чашки разными сторонами тампона с полученным материалом делают последовательно несколько отпечатков. Нанесенный таким образом материал распределяют равномерно по поверхности среды стеклянным или металлическим шпателем. Оставшийся на шпателе материал переносят с первой чашки на вторую и со второй на третью для получения изолированных колоний.

При посеве испражнений небольшое количество материала эмульгируют в 0,1% пептонной воде в отношении 1:10 и оставляют примерно на 10 мин. После оседания крупных частиц с поверхности взвеси берут 0,1 мл и вносят ее близ бортика чашки Петри. Внесенный материал стерильным стеклянным шпателем втирают досуха в питательную среду на небольшом участке в виде круга или овала. Затем, отняв шпатель от этого участка и не прожигая его, распределяют нанесенный материал по всей поверхности среды. Для посева на вторую и третью чашки материал берут заново и засевают его описанным выше способом. Засеянные чашки помещают в термостат при 37°С на 48-72 ч.

Параллельно с высевом на селективный агар исследуемый материал высевают в жидкие среды обогащения. В настоящее время широкое распространение в качестве бульона обогащения для выделения листерий получила среда UVM. Эта среда, наряду с источниками питания, содержит эскулин и ингибиторы посторонней флоры — налидиксовую кислоту и акрифлавина гидрохлорид. Для первичного посева, с целью обогащения, возможно использование бульона с тиамином, где селективными факторами являются калия роданид и налидиксовая кислота.

При использовании этих сред рекомендуется 25,0 г или 25 мл исследуемого материала высевать в 225,0 мл питательной среды. При небольшом количестве или объеме материала, поступившего в лабораторию, посев производят из расчета 1:10. Материал, засеянный в жидкую среду обогащения, инкубируют при 30°С в течение 24-48 ч.

Второй день. Со среды обогащения производят высев 0,1 мл культуры на селективный агар: ПАЛ, Оксфордскую среду или агар PALCAM. Шпателем, распределяют его по всей площади чашки, как описано выше, для получения изолированных колоний. Посевы инкубируют в термостате при 37°С в течение 24-48 ч.

Просматривают чашки с посевами с селективного агара.

Оксфордская среда прозрачная, имеет янтарную окраску с голубым отблеском. Колонии листерий через 24 ч роста — мелкие, диаметром 1,0 мм сероватого цвета, окруженные черным ореолом. Через 48 ч колонии темнеют, вырастают до 1,5-2,0 мм в диаметре, появляется черный ореол.

Агар PALCAM — прозрачный красного цвета. В течение 24 ч инкубации в термостате при 37°С листерии вырастают в виде мелких колоний диаметром 1,0 мм серовато-зеленого или оливково-зеленого цвета с черным центром и характерным черным ореолом на красном фоне среды. Колонии кокков имеют желтый и красный цвет. Через 48 ч размер колоний листерий увеличивается до 1,5-2,0 мм в диаметре. Сохраняется зеленоватая окраска и черный ореол вокруг колонии.

Типичные для L. monocytogenes колонии пересевают на кровяной агар или триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом для накопления культуры и проведения последующего анализа с целью ее идентификации.

Третий день. Выделенную культуру изучают по следующим признакам: морфология клеток, окрашивание по Граму, наличие каталазы, на основании которых можно ориентировочно отнести культуру к роду Listeria. Для подтверждения принадлежности культуры к виду L. monocytogenes ее засевают на среды «цветного ряда» с маннитом, рамнозой и ксилозой, на желточные среды ГРМ №1 с углем и без него для выявления лецитиназы и в 2 пробирки с полужидким агаром для выявления подвижности при 20-22°С. Одну пробирку оставляют при этой температуре, а вторую (контрольную) помещают в термостат на 24 ч. Можно повторно поставить пробу на гемолитическую активность путем посева культуры «уколом» в кровяной агар.

В этот же день просматривают чашки с высевами из сред обогащения, отбирают колонии, подозрительные на листерии, отсевают их на пробирки со скошенным агаром (кровяным, сывороточным и т.д.) для дальнейшего изучения и идентификации выделенной культуры.

Четвертый день. Производят учет изменений на дифференциально-диагностических средах; определяют подвижность при 20-22°С. Выделенную культуру проверяют на чувствительность к антибиотикам общепринятым дискодиффузионным способом.

В этот же день возможна выдача окончательного ответа. В случае изучения культуры, выделенной при помощи среды обогащения, выдача окончательного ответа предполагается на 5-й день.

в) Серологическая диагностика листериоза. В нашей стране в 60-е годы прошлого столетия серологичесие методы широко использовались для диагностики листериоза, несмотря на то, что еще в 1967 г. один из основоположников школы исследования листериоза И.А. Бакулов обращал внимание на их недостаточную специфичность и несостоятельность как диагностического метода. По его словам, «серологические исследования должны проводиться с целью выявления скрытых больных и бактерионосителей в неблагополучных по листериозу хозяйствах, где наличие заболеваний установлено с помощью клинико-эпизоотических и бактериологических исследований». Первичный диагноз при помощи одних только серологических реакций «не надежен».

В настоящее время серологические методы исследования применяют только как вспомогательные, при этом они полностью сохраняют свое значение для выяснения эпидемической ситуации. Используют реакции связывания комплемента и непрямой гемагглютинации с коммерческими диагностическими препаратами.

- Читать далее "Лечение и профилактика листериоза"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 29.11.2019