а) Виды диагностического материала:

1. При заболевании легких: мокрота, отделяемое верхних дыхательных путей, полученное после аэрозольный ингаляции, промывные воды бронхов, материал, полученный при бронхоскопии, плевральная жидкость, биопсия легочной ткани, аспират из бронхов.

2. При внелегочном заболевании, мазки из гортани, экссудаты, промывные воды желудка, моча, спинномозговая, перикардиальная, синовиальная или асцитическая жидкость, кровь, гной, гнойно-некротические массы, пунктат костного мозга, резецированная ткань, грануляции, соскоб с раневой поверхности, лимфатический узел или пунктат из него.

Материал для исследования на кислотоустойчивые микобактерии (КУМ) собирают в стерильные контейнеры с плотно завинчивающимися крышками.

б) Бактериоскопическое исследование. В КДЛ ОЛС используется метод прямой микроскопии, когда мазок готовится непосредственно из необработанного диагностического материала. В специализированных лабораториях используется метод непрямой микроскопии, когда мазок готовится из осадка материала после его обогащения методом центрифугирования.

1. Оборудование и реактивы для проведения микроскопического исследования при окраске по методу Циля-Нельсена. Для приготовления мазков необходимы:
• контейнеры с поступившим в лабораторию исследуемым материалом;
• деревянные палочки или бактериологические петли диаметром 3 мм для забора комочков мокроты или другого материала и распределения их на стекле;
• одноразовые предметные стекла (обезжиренные, без царапин и сколов);
• несмываемый при окраске маркировочный карандаш для нанесения номера на стекло;
• спиртовка или газовая горелка для фиксации мазка;
• лотки (подносы), выстланные фильтровальной бумагой для просушивания приготовленных мазков;
• контейнеры для сбора и последующего обеззараживания (автоклавирования) инфицированного материала и загрязненной посуды;
• емкость с дезинфицирующим раствором для обработки поверхности стола и других объектов при случайном попадании на них диагностического материала и по окончании работы.

Подготовка предметных стекол к работе:

Новые предметные стекла кипятят в 1 %-ном растворе питьевой соды (10 г двууглекислого натрия на 1 л воды), промывают в 1 %-ном растворе соляной кислоты (к 1 л воды добавляют 10 мл концентрированной соляной кислоты), а затем в проточной воде. Протирают насухо. Для обезжиривания вымытые и высушенные стекла помещают в герметически закрытые емкости со смесью Никифорова или с 96° этиловым спиртом. Стекла должны подвергаться обезжириванию не менее 24-48 часов. Непосредственно перед приготовлением мазков стекла повторно протираются насухо.

2. Приготовление мазков из нативного материала или осадка жидкого материала. Перед приготовлением мазка на один конец стекла наносят номер пробы исследуемого материала, под которым он зарегистрирован в лабораторном регистрационном журнале. Номер наносят с помощью воскового карандаша по стеклу или несмываемого маркера с таким расчетом, чтобы в процессе окраски этот номер сохранился.

При приготовлении мазков стекла берутся за ребра. Так как в необработанном нативном материале микобактерии наиболее часто располагаются в плотных гнойных комочках, следует иметь в виду, что результат микроскопическою исследования в значительной степени зависит от правильности выбора этих гнойных комочков. При приготовлении мазков удобнее всего пользоваться деревянной палочкой, которую перед выбором материала разламывают пополам. Забор материала производят с помощью сломанного конца палочки, что обеспечивает более надежную фиксацию материала к палочке и облегчает последующее его нанесение на поверхность предметного стекла круговыми движениями палочки («плетение кружев»).

Приготовленные мазки помещают на лотки (подносы), выстланные фильтровальной бумагой для высушивания при комнатной температуре в вытяжном шкафу. Стекла с высохшими мазками фиксируют — берут пинцетом за конец, на который нанесена маркировка, и трижды медленно проводят через верхнюю треть пламени спиртовки или газовой горелки до исчезновения признаков запотевания стекла. Затем стекла помещают на «рельсы» для окрашивания.

3. Окраска препаратов для световой микроскопии по методу Циля-Нельсена. Метод окраски по Цилю-Нельсену является наиболее употребляемым и распространенным методом для выявления кислотоустойчивых микобактерий.

Для окраски мазков по методу Циля-Нельсена необходимы:
• раковина или специальный вместительный лоток для окраски;
• специальный штатив — «рельсы» для окраски мазков на предметных стеклах;
• пинцет или щипцы для взятия предметных стекол с мазками;
• газовая или спиртовая горелка для фиксации препарата и подогревания его при окрашивании карболовым фуксином;
• фильтровальная бумага размером 4 х 1,5 см для окраски мазков карболовым фуксином;
• раствор карболового фуксина;
• 25%-ный раствор серной кислоты или 3 %-ный солянокислый спирт для обесцвечивания мазков после окраски их карболовым фуксином;
• дистиллированная вода для промывания мазков;
• 0,3%-ный раствор хлорида метиленового синего для окраски фона мазка после его обесцвечивания;
• штатив для просушивания окрашенных стекол на воздухе в вертикальном или наклонном положении.

Приготовление растворов:

Раствор 1. Насыщенный спиртовой раствор фуксина:
• растереть в ступке 0,3 г основного фуксина с 2-3 каплями глицерина;
• добавить по каплям 10 мл 960 этилового спирта.

Раствор 2. Рабочий раствор фенола (5 %-ный водный раствор):
• расплавить 5 г кристаллического фенола путем легкого подогревания на водяной бане (так как температура плавления фенола + 41°С); добавить слегка подогретой дистиллированной воды до 100 мл общего объема.

Раствор 3. Рабочий раствор карболового фуксина:
• в 90 мл полученного раствора фенола (раствор 2) добавить 10 мл насыщенного раствора фуксина (раствор 1).

Раствор 4. Обесцвечивающий раствор:
а) 25%-ный раствор серной кислоты, к 75 мл дистиллированной воды осторожно долить 25 мл концентрированной серной кислоты (H₂SO₄), постепенно наслаивая ее по стенкам сосуда; смешать; содержимое нагреется.
б) 3%-ный солянокислый спирт, к 97 мл 96° этилового спирта осторожно добавить 3 мл концентрированной соляной кислоты (НС1).

Раствор 5. Рабочий раствор метиленового синего:
• растворить 0,3 г хлорида метиленового синего в 100 мл дистиллированной воды.

Процедура окраски:
• убедитесь, что подготовленные мазки фиксированы и промаркированы;
• стекла помещают на подставку — «рельсы» так, чтобы они не касались друг друга, расстояние между их боковыми краями составляло порядка 1 см, а маркировка (номер анализа) была направлена в одну сторону. Максимально на стандартные «рельсы» помещают не более 12 стекол;
• на каждое стекло накладывают полоску фильтровальной бумаги так, чтобы она полностью закрывала мазок. Фильтровальную бумагу используют для того, чтобы краска не разливалась по стеклу. Одновременно за счет использования фильтровальной бумаги предотвращается осаждение на мазок кристаллов краски, которые при микроскопическом исследовании могут быть ошибочно приняты за кислотоустойчивые микобактерии (ложноположительный результат);
• наливают на бумагу раствор карболового фуксина с избытком и нагревают мазок над пламенем спиртовки до появления паров над стеклом. При подогревании препарата следует внимательно следить за тем, чтобы краска не закипела, а фильтровальная бумага не высохла. Подогретый мазок оставляют на 5 минут, чтобы краситель проник в клеточную стенку микобактерий и окрасил ее;
• пинцетом снимают и удаляют фильтровальную бумагу;
• осторожно смывают остатки краски слабой струей проточной воды или водой из резервуара до тех пор, пока не прекратится видимое отхождение краски;
• перед тем как нанести на стекло следующий краситель или обесцвечивающий раствор, щипцами или пинцетом берут каждое стекло за маркированный конец и наклоняют так, чтобы с него стекла вода; это предотвращает разбавление следующего реактива;
• мазок обесцвечивают в течение 3 минут одним из обесцвечивающих растворов — 25 %-ным раствором серной кислоты или 3%-ным раствором солянокислого спирта. Раствор наливают до полного покрытия всей поверхности мазка;
• мазок тщательно промывают водой и докрашивают в течение 1 минуты 0,3 %-ным раствором метиленового синего;
• вновь аккуратно промывают водой, наклоняя каждое стекло, чтобы стекала вода;
• высушивают на открытом воздухе при комнатной температуре в вертикальном или наклонном положении.

Не следует промокать препарат!

В мазке видны туберкулезные и нетуберкулезные микобактерии, окрашенные в малиново-красный цвет на голубом фоне.

Препарат микроскопируют с масляной иммерсией в световом микроскопе.

4. Для окраски микобактерий можно использовать флюорохромные красители. Метод люминесцентной микроскопии основан на способности микроорганизмов к свечению. По сравнению с методами обычной микроскопии исследование в свете люминесценции обладает рядом преимуществ: яркое свечение, высокая степень контрастности светящихся объектов на темном фоне, большая площадь поля зрения и др. Однако люминесцентные методы микроскопии требуют закупки дорогостоящего оборудования и реактивов, поэтому в КДЛ ОЛС этот метод не применяется.

Для проведения микроскопического исследования при окраске по методу Циля-Нельсена необходимы:
• бинокулярный микроскоп;
• иммерсионное масло терпеновое (кедровое);
• капельница для нанесения масла на препарат;
• штатив с окрашенными и высушенными мазками, которые должны быть расположены в порядке номеров регистрации;
• мягкая хлопчатобумажная ткань или бумажные салфетки для протирания линз микроскопа;
• емкость с дезинфицирующим средством

Для исследования мазков, окрашенных по Цилю-Нельсену, используют световой бинокулярный микроскоп с иммерсионным объективом 90х или 100х и окуляром 7х или 10х.

5. Морфологическая характеристика кислотоустойчивых микобактерий при окраске по методу Циля-Нельсена. При окраске по Цилю-Нельсену микобактерии выглядят красными на синем фоне, а при окраске люминесцентными красителями — желто-зелеными или оранжевыми на темно-синем фоне. Кислотоустойчивые микобактерии имеют в длину от 1 до 10 мкм, в ширину — 0,2-0,6 мкм. Обычно М. tuberculosis видны в виде тонких изящных палочек, но иногда можно обнаружить изогнутые или извитые варианты. НТМБ могут иметь форму коккобацилл, коротких или средней длинны палочек. При осмотре мазка следует обратить внимание на морфологические особенности палочек и расположение их в препарате.

Клетки М. avium представляют собой короткие палочки или коккобациллы, хотя иногда встречаются длинные тонкие палочки. М. kansasii иногда можно идентифицировать в мазках из патологического материала по их большому размеру и крестообразному расположению. М. xenopi при исследовании мазков мокроты или другого патологического материала выглядят как тоненькие палочки, суживающиеся с одного конца в виде маленькой свечки. Эту специфическую форму М. xenopi нельзя не заметить под микроскопом. При бактериоскопии мазков М. fortuitum часто наблюдается значительный полиморфизм — от длинных до коротких толстых палочек. Иногда форма клетки может напоминать четки или булаву, на одном конце клетки могут быть видны неокрашенные яйцевидные тельца. Быстрорастущие микобактерии могут отличаться по степени кислотоустойчивой окраски — при частичной потере кислотоустойчивости они приобретают фиолетово-малиновый цвет. Для НТМБ в мазках, приготовленных из культуры, характерно расположение бактерий параллельно друг другу — наподобие частокола.

Группа родственных микроорганизмов (нокардии, родококки и др.) отличается частичной или слабой кислотоустойчивостью, и в мазке можно одновременно встретить красные и синие палочки.

Несмотря на то, что морфологическая характеристика палочек может ассоциироваться с определенным видом МБ, она не является основанием для видовой идентификации.

6. Порядок проведения микроскопического исследования. Исследование мазков, окрашенных по методу Циля-Нельсена, производится в проходящем свете с помощью светового микроскопа. Исследование рекомендуется производить с помощью бинокулярного микроскопа или монокулярного микроскопа, оснащенного бинокулярной насадкой.

При микроскопическом исследовании мазка, окрашенного но Цилю-Нельсену, следует просматривать не менее 100 полей зрения, чтобы дать количественную оценку препарату и обнаружить единичные микобактерии. В том случае, если результат такого исследования оказывается отрицательным, рекомендуется просмотреть еще 200 полей зрения. При значительном количестве кислотоустойчивых микобактерий достаточно исследовать 20-50 полей зрения.

При микроскопическом исследовании препарата рекомендуется просматривать препарат всегда по одной и той же схеме:
• либо 3 параллельных прохода по длине препарата,
• либо 9 параллельных проходов по ширине.

Если увеличение микроскопа составляет 1000х (100х — для масляно-иммерсионного объектива и 10х — для окуляра), при исследовании одной длины мазка (20 мм) за один продольный проход просматривается около 100-120 полей зрения.

Перед тем как взять для исследования следующий препарат, необходимо протереть иммерсионную линзу кусочком специальной ткани или ватным тампоном.

По окончании микроскопического исследования всей партии мазков нужно выполнить следующие процедуры:
• с помощью бумажной салфетки протереть линзы микроскопа спирто-эфирной смесью или спиртом;
• опустить предметный столик микроскопа, отдалив его от объективов;
• уменьшить интенсивность освещения и выключить источник освещения микроскопа;
• покрыть микроскоп полиэтиленовым или иным пластиковым пакетом;
• перенести результаты микроскопического исследования в лабораторный регистрационный журнал и на бланки ответов.

7. Учет результатов микроскопического исследования при окраске по Цилю-Нельсену. Количество кислотоустойчивых микобактерий (МБ), обнаруживаемых при микроскопическом исследовании, является очень важным показателем, так как оно характеризует степень эпидемиологической опасности больного и тяжесть заболевания. Поэтому микроскопическое исследование должно быть не только качественным, но обязательно также количественным. Рекомендуется использовать следующую градацию результатов световой иммерсионной микроскопии.

Отрицательный результат бактериологического исследования не исключает диагноз микобактериального заболевания, так как в материале больного может содержаться меньше микобактерий, чем способен выявить данный метод.

Следует еще раз подчеркнуть, что бактериоскопическое исследование является первым, наиболее простым, быстрым и дешевым методом выявления кислотоустойчивых микобактерий. Однако пределы метода даже при использовании самой совершенной микроскопической техники позволяют обнаружить микобактерии при содержании не менее 10 тыс. микробных клеток в 1 мл материала. Кроме того, микроскопическое выявление кислотоустойчивых микобактерий не позволяет дифференцировать микобактерии туберкулезного комплекса от нетуберкулезных микобактерий — потенциальных возбудителей микобактериоза и сапрофитов. Таким образом, микроскопические исследования не дают возможности определить вид микобактерий.

Поэтому, если при бактериоскопическом исследовании материала у больного выявлены кислотоупорные палочки, необходимо:
• углубленное клиническое обследование больного
• культуральное исследование материала больного

- Читать далее "Культуральный метод выявления микобактерий (метод посева)"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 29.3.2020