Культуральный метод выявления микобактерий, или метод посева, отличается большей чувствительностью по сравнению с методом микроскопии. Он позволяет выявлять микобактерии при наличии в исследуемом патологическом материале нескольких десятков жизнеспособных особей возбудителя. Он также позволяет:
• достоверно подтвердить микобактериальную природу заболевания;
• определить таксономическую принадлежность возбудителя;
• определить лекарственную чувствительность возбудителя;
• определить вирулентность и другие биологические свойства возбудителя.

В связи с вышеизложенным культуральное исследование следует применять у детей и взрослых во всех случаях подозрения на туберкулез легких, микобактериальную инфекцию и поражении других органов и систем с невыясненной этиологией заболевания. Посев материала необходимо также проводить для дифференциальной диагностики туберкулеза с лекарственно-устойчивыми штаммами микобактерий и микобактериоза, вызываемого нетуберкулезными микобактериями, обладающими естественной устойчивостью к антибиотикам и химиопрепаратам широкого спектра действия.

а) Режимы и кратность обследования больных. В микробиологических лабораториях противотуберкулезной службы используется схема, предусматривающая не менее чем 3-х кратное исследование мокроты или другого диагностического материала в течение 3 последовательных дней.

Материал для исследования на микобактерии собирают в стерильный контейнер с плотно завинчивающейся крышкой. Для повышения эффективности бактериологического исследования диагностического материала необходимо соблюдать следующие условия:
• сбор материала производить до начала химиотерапии;
• при прохождении курса лечения отменять противотуберкулезные препараты не менее чем за двое суток до сбора материала;
• материал для исследования собирать до утреннего приема лекарственных препаратов.

При легочных формах заболевания наиболее информативным материалом является мокрота; кроме того, исследуют отделяемое верхних дыхательных путей, полученное после аэрозольных ингаляций; промывные воды бронхов; бронхоальвеолярные смывы; материал, получаемый при бронхоскопии, транстрахеальной и внутрилегочной биопсии; аспират из бронхов; ларингеальные мазки; экссудаты; мазки из торакальных ран; промывные воды желудка (преимущественно у детей).

При внелегочных формах заболевания исследуется самый разнообразный материал; различные тканевые жидкости (спинномозговая, плевральная, перикардиальная, синовиальная, асцитическая, кровь, гной), пунктат костного мозга, резецированные ткани того или иного органа, полученные при биопсиях или оперативных вмешательствах, гнойно-некротические массы, грануляции, соскобы пораженных тканей, синовиальные оболочки, лимфатические узлы.

При внелегочных формах процесса можно выделить 2 группы диагностических материалов:
• асептически полученный материал, обычно свободный от сопутствующей загрязняющей микрофлоры — спинномозговая, плевральная, перикардиальная, синовиальная, асцитическая жидкости, кровь, гной, пунктат костного мозга, резецированная ткань. Асептически собранный материал засевается на питательные среды без предварительной деконтаминации;
• заведомо загрязненный материал из открытых очагов поражения, в отношении которого заранее известно, что он контаминирован сопутствующей микробной флорой или собран без соблюдения правил асептики. К заведомо загрязненным материалам относится также моча, менструальная кровь. Исследование каждого из этих материалов требует дополнительных методов обработки.

б) Предпосевная обработка диагностического материала. Обычные микробиологические методики, заключающиеся в посеве исследуемого клинического материала на селективные или дифференциальные питательные среды с целью выделения чистых культур возбудителей, не могут быть использованы при проведении бактериологических исследований для выделения микобактерий. Это объясняется тем, что рост микобактерий происходит медленно или очень медленно. Колонии микобактерий, видимые невооруженным глазом, появляются через 4-5 дней или 4-6 недель. Большинство проб клинического материала, поступающего в микробиологическую лабораторию для посева на микобактерии, в различной степени загрязнены быстрорастущими бактериями, бурный рост которых мешает развитию микобактерий и затрудняет их выделение. Поэтому перед посевом на питательную среду диагностический материал подвергают обязательной специальной обработке, обеспечивающей его обеззараживание (деконтаминацию), то есть гибель гноеродной и гнилостной микрофлоры.

Для предпосевной обработки диагностического материала рекомендуется использовать следующие методы и детергенты.

1. Обработка материала 10%-ным раствором трехзамещенного фосфорнокислого натрия. Трехзамещенный фосфорнокислый натрий (Na₃PO₄) хорошо подавляет сопутствующую флору и даже при 2-3-х-дневном хранении материала при температуре +4°С не повреждает микобактерии и мало влияет на их способность к росту на питательных средах. Время обработки материала — 18 часов в термостате при 37°С.

Приготовление раствора. Трехзамещенный фосфорнокислый натрий (Na₃PO₄) — ГОСТ 4274-76;
100 г трехзамещенного фосфата натрия растворяют в 800 мл дистиллированной воды и доводят объем раствора до 1 л. Раствор стерилизуют 20 мин при 1 атмосфере.

2. Обработка материала 3%-ной серной кислотой. Микобактерии обычно не теряют жизнеспособность в сильно закисленной среде. Необходимо помнить, однако, что длительная экспозиция материала в растворе серной кислоты действует на них губительно. Поэтому раствором серной кислоты производят обработку материала, содержащего большое количество сопутствующей микрофлоры. Этот метод рекомендуется для обработки мочи, гнойных экссудатов, отделяемого ран, резецированных тканей, органов экспериментальных животных и пр. Время обработки материала — 20 мин.

Приготовление раствора. Серная кислота (H₂SO₄) концентрированная (ГОСТ 4204-77);
К 97 мл дистиллированной воды добавляют 3 мл концентрированной серной кислоты, осторожно наслаивая ее по стенкам сосуда.

3. Обработка материала 4%-ным раствором едкого натра (модифицированный метод Петрова). Обработка с помощью NaOH является достаточно жесткой и может приводить к гибели до 60 % микобактерий, содержащихся в исследуемом материале. Гидроокись натрия токсична по отношению как к загрязняющим микроорганизмам, так и к микобактериям. Поэтому при использовании данного метода необходимо строго соблюдать указанное время обработки. Общее время обработки не должно превышать 40 мин.

Приготовление раствора:
Едкий натр (NaOH) — ГОСТ — 4328-77;
40 г едкого натра заливают дистиллированной водой до объема 1 л. Раствор стерилизуют 20 мин при 1 атмосфере.
После деконтаминации посевы инкубируют при 37°С в течение 10-12 недель.

в) Материалы, не нуждающиеся в деконтаминации. Биологические жидкости и ткани не нуждаются в деконтаминации, если они были взяты в стерильные флаконы с соблюдением правил асептики:
• спинномозговая, синовиальная и другие жидкости (обычно стерильные);
• костный мозг;
• гной из «холодных» абсцессов;
• резецированные ткани (за исключением материала аутопсии);
• пунктаты печени и лимфатических узлов, а также материалы биопсий.

г) Процедура посева. После обработки диагностического материала одним из вышеуказанных методов, следует процедура посева на плотные питательные среды. «Золотым стандартом» во всем мире остается посев диагностического материала на яичную среду Левенштейна-Йенсена. В нашей стране широко применяется посев на яичную среду Финна-II. Соблюдая условия стерильности, внести равные объемы материала (примерно по 0,2-0,3 мл) в 2 пробирки с разными плотными питательными средами:

• засеянные пробирки закрыть ватно-марлевыми пробками и поместить в штатив, который привести в наклонное положение (под углом 40-45°) таким образом, чтобы посевной материал равномерно распределялся по всей поверхности косяка питательной среды;

• по завершении посева всех проб засеянные пробирки в наклонном положении помещают в термостат при температуре 37°С.

д) Инкубация. Инкубация посевов имеет свои особенности. Они заключаются в том, что микобактерии размножаются чрезвычайно медленно. Рост отдельных штаммов появляется через 60 и даже 90 дней. Это обуславливает необходимость при отсутствии роста микобактерий выдерживать посевы в термостате до 12 недель для выдачи отрицательного результата.

е) Питательные среды. Для посева диагностического материала используют разнообразные питательные среды, среди которых можно выделить 3 основные группы:
• плотные питательные среды на яичной основе;
• плотные или полужидкие питательные среды на агаровой основе;
• жидкие синтетические и полусинтетические питательные среды.

Каждая из этих сред имеет положительные и отрицательные особенности.

В связи с этим для повышения результативности культурального метода рекомендуется применять посев диагностического материала одновременно на 2-3 питательные среды разного состава.

В результате многочисленных сравнительных испытаний установлено, что для культуральной диагностики микобактерий следует использовать как минимум две разные по составу питательные среды. Наиболее широкое распространение получил набор из 2 яичных сред — Левенштейна-Йенсена и Финна II.

Все реактивы, используемые для приготовления сред, должны иметь степень очистки не ниже категории «химически чистый» (ХЧ). Могут использоваться как отечественные, так и импортные реактивы, имеющие степень очистки не менее чем «химически чистый» (см. Приказ М3 № 109 от 2003 г.).

ж) Оценка результатов посева. Для выявления роста микобактерий проводится еженедельный просмотр посевов.

При просмотре посевов необходимо регистрировать следующие параметры:
• скорость роста — срок появления колоний, начиная со дня посева;
• массивность роста — число колоний (КОЕ);
• загрязнение посева посторонней микрофлорой или грибами (контаминация);
• отсутствие роста.

Соблюдение этих правил позволяет, во-первых, своевременно выявлять макроскопически видимый рост микобактерий или загрязняющей микрофлоры, а во-вторых, на основании регистрации сроков появления роста и его особенностей осуществлять первичную идентификацию микобактерий. При этом необходимо иметь в виду:
• появление роста кислотоустойчивых микобактерий в течение 7-10 дней культивирования на плотных питательных средах свидетельствует о выделении быстрорастущих нетуберкулезных микобактерий;
• появление роста кислотоустойчивых микобактерий после 3-4 недель культивирования свидетельствует о выделении как М. tuberculosis, так и других медленнорастущих микобактерий, которые могут относиться к потенциально патогенным микобактериям или к кислотоустойчивым сапрофитам.

з) Характеристика колоний. Культуры классических микобактерий туберкулеза, выросших на плотных питательных средах, имеют колонии различной величины с шероховатой поверхностью, напоминающие манную крупу или цветную капусту (R-форма). Колонии имеют желтоватый или слегка кремовый оттенок (цвет слоновой кости). Колонии, как правило, сухие, морщинистые, но в случае диссоциации могут встречаться и влажные, слегка пигментированные колонии. В то же время сапрофитные и потенциально патогенные микобактерии могут иметь окраску от слабо-желтого до оранжевого пигмента. Колонии НТМБ чаще всего бывают гладкими, выпуклыми, легко мажущимися при приготовлении мазка (S-форма). Однако некоторые виды нетуберкулезных микобактерий (М. kansasii, М. fortuitum) могут расти в виде R-формы, характерной для микобактерий туберкулеза, что приводит иногда к ложноположительным ответам.

и) Учет результатов посева диагностического материала. Интенсивность роста обозначают по 3-х балльной системе:
(1+): 1-20 КОЕ — «скудное» бактериовыделение;
(2+): 21-100 КОЕ — «умеренное» бактериовыделение;
(3+): свыше 100 КОЕ — «обильное» бактериовыделение.

- Читать далее "Автоматические анализаторы для выявления микобактерий"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 29.3.2020