Существует много бактериологических и биохимических методов идентификации НТМБ, однако для их применения требуется очень много времени, хотя бы потому, что МБ относятся к числу медленнорастущих микроорганизмов. Внедрение в практику фтизиобактериологии молекулярно-генетических методов способствовало совершенствованию диагностики и значительному сокращению времени, требующегося для получения результата исследования.

Молекулярно-генетические методы основаны на применении полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая амплифицирует, т.е. многократно, в миллионы раз увеличивает число участков специфической последовательности ДНК при циклическом повторении трех стадий реакции:

1 стадия: изменение структуры ДНК (денатурация) при нагревании с расхождением цепей ДНК;

2 стадия: связывание с денатурированной ДНК синтетических олигонуклеотидов (праймеров), специфических к концевым участкам конкретного фрагмента ДНК-мишени микобактерии;

3 стадия: синтез и достройка цепи ограниченного по флангам фрагмента ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы.

Многократное удвоение специфических фрагментов ДНК приводит к увеличению их количества до уровня, который может быть обнаружен тем или иным методом детекции ДНК. Результаты ПЦР оценивают с помощью агарозного гель-электрофореза, при котором оценивается размер исследуемого фрагмента ДНК в сопоставлении с фрагментом ДНК в контроле. Применение этого метода ограничено количеством видоспецифических праймеров, разработанных для детекции отдельных видов микобактерий.

В основе различных методов гибридизации также лежит оценка результата ПЦР-продукта со специфическими ДНК-зондами. GEN-проба основана на видовой специфичности ДНК-зонда, который гибридизуется с рРНК микобактерий. Зонды метят акридиновым эфиром и результаты считывают с помощью люменометра. Разработаны коммерческие тест-системы для идентификации М. tuberculosis complex, М. avium complex, М. kansasii и М. gordonae. Метод характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью, однако применение его ограничено тем, что набор включает только 5 видов МБ.

Универсальным методом идентификации можно считать сочетание ПЦР с секвени-рованием нуклеиновых кислот. Метод позволяет не только идентифицировать уже известные виды микобактерий, но и открыть еще не известные виды МБ. Гены 16S рРНК стали подходящей мишенью для этой цели. Ген 16S рРНК содержит приблизительно 1500 нуклеотидов. В целом, ген присутствует во всех живых организмах и высококонсервативен. В то же время, полиморфизм по отдельным позициям внутри сравнительно вариабельных участков позволяет проводить как идентификацию рода микобактерий в целом, так и дифференцировать отдельные виды микобактерий и проведение филогенетического анализа. Секвенирование гена 16S рРНК называют «золотым стандартом» идентификации микобактерий. Различные функциональные зоны генов 16S рРНК имеют различную степень консерватизма, сохраняющегося в процессе секвенирования нуклеиновых кислот и обеспечивающего видовую дифференциацию.

Одним из последних методов генотипирования МБ можно считать коммерческие системы, предложенные фирмой Hain Lifescience. В основе метода лежит технология обратной гибридизации продукта ПЦР с видоспецифическими зондами, иммобилизованными на ДНК-стрипах. Имеется два набора реагентов для последовательной идентификации 15-17 видов НТМБ. В одном наборе представлены общие (наиболее часто встречающиеся виды МБ, в том числе М. tuberculosis), в другом, дополнительном наборе представлены менее распространенные виды НТМБ.

Метод рассчитан на исследование культур, выросших на плотных или жидких питательных средах. Процедура выполнения исследования делится на 3 этапа:
• выделение ДНК из исследуемой культуры;
• ПЦР с праймерами, мечеными биотином;
• гибридизация продукта ПЦР (меченого биотином) со стрипом, который содержит видоспецифические зонды, нанесенные в виде дискретных полосок.

Выявление продукта гибридизации в результате иммуноферментной цветной реакции и сравнение полученного результата (сигнала гибридизации на стрипе) с шаблоном для определения соответствия выявленного сигнала гибридизации тому или иному виду микобактерий.

Применение молекулярно-генетических методов для идентификации микобактерий значительно ускоряет получение результата исследования и способствует точному определению вида НТМБ.

Вышеперечисленные методы идентификации — хроматография и молекулярно-генетические исследования — удобны для применения, обладают высокой чувствительностью и специфичностью, требуют мало времени для получения результата. Однако они относятся к дорогостоящим методам и могут быть использованы в лабораториях третьего уровня, куда поступает большое количество МБ для идентификации.

- Читать далее "Методы определения лекарственной чувствительности нетуберкулезных микобактерий"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 31.3.2020