Лабораторная диагностика стафилококковой инфекции

Ключевым звеном как для лечения, так и для профилактики ВБИ является идентификация возбудителя, которая должна осуществляться в минимально короткие сроки. Показано, что неадекватное назначение стартовой антимикробной терапии драматически ухудшает прогноз заболевания, особенно в случае тяжелых, генерализованных форм инфекционного процесса. Большим недостатком классических бактериологических методов диагностики является трудоемкость и длительность проведения исследования, которое, как правило, занимает не менее 3-5 рабочих дней, а в случае исследования гемокультуры может достигать 2 недель. Совершенно очевидно, что длительность проведения бактериологических исследований приводит к тому, что его результаты оказываются фактически более важными для мониторинга резистентности микроорганизмов в стационаре, чем для лечения данного конкретного пациента. Лечение больного проводится часто необоснованно, чисто эмпирически, а в случае тяжелых форм инфекционного процесса с учетом всех вероятных возбудителей и возможностей стационара. Это, с одной стороны, нередко способствует менее благоприятному исходу болезни, с другой — значительно увеличивает прессинг антибиотиков в стационаре и расходы на лечение. Тем не менее, поскольку до настоящего времени микробиологические методы являются основными для диагностики ВБИ в условиях большинства бактериологических лабораторий, остановимся на основных этапах диагностики стафилококковой инфекции, заостряя внимание на некоторых существенных деталях.

Выделение и идентификация стафилококков. Материалом для исследования могут служить кровь, гнойное и серозное отделяемое воспалительных очагов, биоптаты из ран и пораженных органов, мокрота, эндотрахеальный аспират, грудное молоко, жидкость из серозных полостей, мазки со слизистой носа, зева, цереброспинальная жидкость, моча, кал. Посев биологического материала осуществляют до начала специфического антимикробного лечения или не менее чем через 12 часов после последнего приема антимикробных препаратов.

Первый день. Посев исследуемого материала, за исключением крови, производят на агаризованные селективные и неселективные среды. В качестве селективных используют маннит-солевой агар с добавлением желтка, молочно-желточно-солевой агар, агар Baird-Parker с добавлением теллурита калия. Параллельно производят посев на агар с добавлением эритроцитов. Можно использовать цельную кровь в количестве 5 % по объему или стерильные эритроциты кролика, барана, человека (в несколько меньшем количестве). Наиболее чувствительными к действию альфа-токсина S. aureus являются эритроциты кролика. Посевы инкубируют в аэробных условиях при температуре 35-37°С на протяжении 18-48 час.

Кровь для посева берут стерильно из вены в количестве 5-10 мл и у постели больного засевают в специально предназначенные флаконы для гемокультур, содержащие жидкие или двухфазные питательные среды. Количество среды должно приблизительно в 10 раз превышать количество исследуемой крови. Взятие крови целесообразно осуществлять на фоне подъема температуры у больного. Рекомендуется делать двукратные посевы крови с интервалом в 30 мин или одновременно в разные флаконы из двух кубитальных вен. Посевы крови инкубируют в термостате при 37°С в течение 10 дней. При наличии признаков роста производят высев на кровяной и желточно-солевой агар с маннитом. Однократное обнаружение S. aureus в чистой культуре является диагностически значимым. В тех случаях, когда в посеве обнаруживают коагулазонегативные стафилококкоки, многие эксперты рекомендуют считать диагностически значимым только обнаружение одинаковых по своим фенотипическим свойствам изолятов в парных посевах.

Второй-третий дни. Просматривают выросшие на плотной питательной среде колонии. Медленный рост стафилококков нередко наблюдается при исследовании материала от больных, ранее получавших антимикробные препараты. Отмечают цвет выросших колоний, тип гемолиза, способность ферментировать маннит в аэробных условиях (изменение цвета индикатора на среде с маннитом), учитывают ореолы вокруг колоний, свидетельствующие о наличии лецитиназы и протеиназы (на желточных молочных средах), делают мазки из типичных колоний, окрашивают по Граму, микроскопируют, ставят тест на каталазу. Наличие типичных по морфологии грамположительных кокков с характерным расположением микробных клеток в культуре и положительный каталазный тест позволяют предварительно идентифицировать стафилококк. Производится отсев отдельных выросших колоний (всех различимых морфотипов) для дальнейшего изучения — определения биохимической активности и чувствительности к антимикробным препаратам, бактериофагам, а также, в случае необходимости, дезинфектантам. Уже на этом этапе возможно выделение ДНК из отдельных колоний и дальнейшее изучение свойств возбудителя с использованием молекулярно-генетических технологий.

Четвертый-пятый дни. С целью идентификации принадлежности возбудителя к виду 5. aureus дополнительно проводят несколько дифференциально-диагностических тестов. Это тесты на наличие коагулазной активности, хлопьеобразующего фактора, ДНК-азной активности, сбраживания маннита в анаэробных условиях. При наличии всех положительных реакций и эпидемиологических данных об отсутствии контакта пациента с больными животными принадлежность к виду S. aureus не должна вызывать сомнений.

Необходимо заметить, что многие штаммы S. pseudintermedius, так же как и S. aureus, наряду с коагулазой, обладают лецитиназой и способностью ферментировать маннит в аэробных условиях. Учитывая это, для дифференцирования S. aureus от других коагулазоположительных видов в отдельных случаях, особенно у пациентов с выраженной иммуносупрессией, необходимо проведение исследований с использованием молекулярно-генетических методов. В этих целях можно рекомендовать постановку мультипраймерной ПЦР для идентификации фрагмента амплификации гена имс-термостабильной нуклеазы или изучение структурного полиморфизма одного из генов общего метаболизма — гена gap, кодирующего синтез глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, методом секвенирования. Необходимо иметь в виду, что коммерческих наборов для идентификации наиболее часто встречающихся других коагулазоположительных видов, таких как S. pseudintermedius и S. delphini, в настоящее время не существует.

Схема дифференциации коагулазонегативных видов стафилококка достаточно трудоемка и требует выполнения большого количества тестов. Набор этих тестов и их число значительно варьирует не только у разных авторов, но и у производителей тест-систем. Можно воспользоваться рядом коммерческих наборов, основанных на исследовании биохимической активности, производства фирм BD Diagnostic Systems (США), BioMerieux (Франция), Lachema (Чехия) и др. Учет результатов производится, как правило, через 24 часа инкубации при 37°С.

Идентификация может быть выполнена и с использованием полуавтоматических анализаторов, таких как Vitek-2 (BioMerieux) и Phoenix (BD Diagnostic Systems), позволяющих сократить время диагностики до 5 часов с момента получения чистой культуры возбудителя. Однако специфичность систем, основанных на изучении экспрессии фенотипических признаков, как правило, не превышает 70-80%.

В последние годы для идентификации коагулазонегативных стафилококков был предложен ряд молекулярно-генетических методов, основанных на изучении полиморфизма структуры ряда генов общего метаболизма, в том числе 16S рРНК, hsp60, sodA, tuf, gap методом секвенирования. Специфичность такой идентификации достигает 98-100%. Однако секвенирование требует дорогостоящего оборудования и специально подготовленного персонала. Время, необходимое для амплификации одного из генов, последующего секвенирования и анализа полученных результатов составляет 24-48 час.

Альтернативой секвенированию являются разработанные рядом фирм тест-системы, использующие для идентификации варианты ПЦР в формате реального времени или обычной мультипраймерной ПЦР-реакции, детекция продуктов которой осуществляется не с помощью традиционного электрофореза, а с использованием специальных диагностических стрипов (бумажных полосок). Предложен ряд методов диагностики, не требующих предварительных культуральных исследований, позволяющих проводить идентификацию возбудителя непосредственно в образце клинического материала. Такие методики используют, как правило, несколько модулей, в которых этапы выделения ДНК, амплификации и детекции автоматизированы. Разработан оригинальный дизайн праймеров, оптимизированы условия амплификации и детекции. Это позволяет получать результаты в течение нескольких часов с момента поступления материала для исследования в лабораторию. Фирма Seegene (США, Ю. Корея) предложила две технологии: Seeplex и Magiplex. В Seeplex-системе идентификация осуществляется на основе мультиплексной ПЦР. Анализ продуктов реакции производят с помощью высокоскоростной автоматизированной системы с использованием микрочипа. Не требуется применение этидиум-бромида, буфера, гель-документирующей системы. Система позволяет идентифицировать 25 основных патогенов, вызывающих сепсис.

Среди них S. aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Stenotrophomonas maltophilia и др. Дополнительные панели предназначены для дифференциации 22 видов стафилококка и 24 видов стрептококка. Система обеспечивает одновременное выявление 13 респираторных вирусов и 5 бактерий, вызывающих пневмонию, в одной пробирке. Еще более чувствительной является система Magiplex, представляющая некий комплекс между обычной ПЦР и реакцией в формате реального времени. Для анализа необходим только 1 мл крови больного и не требуется положительная гемокультура. Методика позволяет осуществлять скрининг до 90 патогенов, вызывающих сепсис, идентифицировать 27 видов и три маркера резистентности. Время исследования составляет 6 часов с момента взятия крови. Фирма Hain Lifescience Gmbh (Германия) разработала оригинальный метод детекции продуктов амплификации с использованием ДНК-стрипов. Предлагаются два варианта методики. DNA-strip Technology и GenoQuick Technology. Методики позволяют проводить анализ непосредственно клинических образцов в течение 4-х часов. С их помощью можно осуществлять выявление MRSА, и проводить генотипирование, определяя тип стафилококковых хромосомных кассет, детерминирующих устойчивость к бета-лактамным антибиотикам.

Другой стрип позволяет дифференцировать S. aureus, S. epidermidis, определять meek, детерминирующий устойчивость к бета-лактамным антибиотикам, ген pvl, кодирующий синтез лейкоцидина Пантона-Валентайна, ассоциируемого с развитием некротизирующей формы пневмонии. Еще один стрип позволяет определять гены pvl, meek и идентифицировать 6 коагулазонегативных видов стафилококка, наиболее патогенных для человека. Уникальная разработка осуществлена фирмой Cepheid (США). Ее сотрудниками создан картридж, с помощью которого можно осуществить выделение ДНК, выполнить амплификацию и провести идентификацию продуктов реакции в режиме реального времени. Весь процесс осуществляется в закрытом модуле GeneXpert. Анализ может быть проведен на базе обычной микробиологической лаборатории. Разработанные фирмой картриджи позволяют идентифицировать MRSА и S. aureus в материале со слизистой оболочки полости носа, из ран, в положительных гемокультурах, а также проводить идентификацию нескольких типов кассет тес для дифференциации MRSА. Ручная пробоподготовка занимает 2-10 мин. Время реакции составляет около полутора часов. Фирма уже зарегистрировала свою продукцию в РФ.

Завершая этот раздел, необходимо заметить, что до настоящего времени не разработаны ускоренные методы определения чувствительности возбудителей ко всему спектру антимикробных препаратов. Поэтому ускоренные методы диагностики могут быть эффективными только в том случае, если они опираются на результаты локального (характерного для данного места, стационара) мониторинга антибиотикорезистентности основных возбудителей ВБИ.

Определение чувствительности к антимикробным препаратам. Определение чувствительности стафилококков к антибиоти кам проводят согласно Методическим указаниям МУК 4.2. 1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам», Москва, 2004. Не имея возможности подробно остановиться на изложении этого документа, позволим себе обратить внимание читателей на ряд принципиально важных его положений, а также на некоторые изменения в постановке тестов и трактовке полученных результатов, рекомендованные документами CLSI (2009 г.) и EUCAST (2010 г.), и опубликованные позднее, чем упомянутые МУК.

Изучение чувствительности к природным пенициллинам не имеет практического значения, т.к. подавляющее большинство клинических изолятов, особенно среди S. aureus, являются продуцентами бета-лактамаз и потому устойчивы к природным пенициллинам.

Устойчивость к оксациллину является маркером резистентности ко всем бета-лактамным антибиотикам, используемым в настоящее время для клинических целей. Для ее выявления можно использовать либо диско-диффузионный метод, либо метод микроразведений как в бульоне, так и в плотной питательной среде. Однако необходимо отметить, что имеются различия в постановке тестов и в интерпретации полученных результатов для различных представителей рода. Так, для выявления устойчивости S. aureus следует использовать диски, нагруженные оксациллином с содержанием 1 мкг, или метод микроразведений в бульоне, реже — в агаре.

При этом к категории чувствительных относят изоляты с МИК < 2 мкг/мл. При определении чувствительности S. lugdunensis, согласно рекомендациям экспертов CLSI, следует использовать диски с цефокситином (30 мкг) или метод разведений в бульоне. При этом к категории чувствительных следует относить изоляты с МИК < 4 мкг/мл. При определении чувствительности других коагулазоотрицательных видов рекомендуется использовать метод микроразведений в бульоне или агаре. К категории чувствительных относят изоляты с МИК < 0,5 мкг/мл оксациллина.

Определение чувствительности с использованием дисков, нагруженных другими бета-лактамными антибиотиками, может приводить к получению ложноотрицательных результатов. Определение проводят с использованием бульона или агара Мюллера-Хинтона с добавлением в среду NaCl в конечной концентрации 2% (рекомендации CLSI) или 4% (МУК 4.2. 1890-04). Температура инкубации — 35°С. Время инкубации — 18-24 часа для S. aureus и 24-48 часов для других видов. В последние годы для сокращения времени целым рядом фирм (BioRAD; bioMerieux; Becton, Dickinson and Со) предложены хромогенные дифференциально-диагностические среды, позволяющие выявлять MRS А и MRSE. Однако чувствительность и специфичность такой идентификации остается невысокой — не превышает 60-80%. Определение чувствительности может быть выполнено и с помощью полуавтоматических анализаторов, таких как Vitek-2 (BioMerieux) и Phoenix (BD Diagnostic Systems), позволяющих сократить время диагностики до 5 часов. В последние годы предложен ряд коммерческих тест-систем, выявляющих продукцию РВР-2, специфичность которых достигает 90%. Однако «золотым стандартом» является определение гена mecA с помощью ПЦР, в том числе и в формате реального времени.

При определении чувствительности к ванкомицину, согласно рекомендациям CLSI и EUCAST, диско-диффузионный метод может быть использован только для выявления VRSA, несущих ген устойчивости vanA. Для выявления VISA и hVRSA необходимо использовать метод разведений в бульоне или агаре. К категории чувствительных относят изоляты S. aureus с МИК < 2 мкг/мл и МИК < 4 мкг/мл у других видов. Температура инкубации колеблется в пределах 35±2°С. Можно использовать популяционный анализ (высевы на среды с различными концентрациями антибиотика) или Е-тест (нагруженные антибиотиком стрипы различных производителей), хотя они и менее точные.

При определении чувствительности к даптомицину следует использовать только метод микроразведений в бульоне, к которому добавлены ионы Са в конечной концентрации 50 мг/мл. К категории чувствительных относят изоляты, для которых МИК не превышает 1 мкг/мл. Результаты учитывают через 24 часа инкубации.

Следует учитывать ряд особенностей при выявлении резистентости стафилококков к макролидам и линкозамидам. Формирование зоны ингибиции вокруг диска с эритромицином свидетельствует о наличии конститутивного типа резистентности не только к этому препарату, но и к другим антибиотикам из группы макролидов, в том числе азитромицину и кларитромицину. Многие эритромицинустойчивые, но клиндамицин-чувствительные изоляты имеют индуцибельный тип резистентности к клиндамицину/линкомицину. Для выявления индуцибельного типа устойчивости Staphylococcus spp. к клиндамицину, согласно EUCAST, рекомендуется применять диско-диффузионный метод в следующей модификации. Два диска, нагруженные клиндамицином и эритромицином, располагают на расстоянии 15 мм друг от друга. Инкубацию проводят в течение 24 часов. Отсутствие зоны ингибиции вокруг диска с эритромцином и образование D-образной зоны ингибирования роста вокруг диска с клиндамицином/линкомицином напротив диска с эритромицином («палочка» буквы D обращена в сторону диска с эритромицином) свидетельствует о наличии индуцибельного типа резистентности. С клинической точки зрения, использование клиндамицина или линкомицина для лечения инфекционного процесса, вызванного такими стафилококками (с индуцибельным типом резистентности), не рекомендуется.

Согласно правилам EUCAST, интерпретация результатов определения анти-биотикочувствительности Staphylococcus spp. к аминогликозидам осуществляется следующим образом. Если при определении чувствительности Staphylococcus spp. к канамицину значение МИК превышает 8 мкг/мл, рекомендуется сообщать и о его устойчивости к амикацину. Если изоляты Staphylococcus spp. при определении их чувствительности к аминогликозидам проявили резистентность к гентамицину, то их, по EUCAST, следует считать резистентными ко всей группе аминогликозидов.

Таким образом, при исследовании чувствительности стафилококков к антимикробным препаратам следует выявлять устойчивость к оксациллину, эритромицину, клиндамицину/линкомицину, канамицину, гентамицину, тетрациклину (доксициклину), хлорамфениколу, ципрофлоксацину, фузидину. В случае выявления метициллин/оксациллин-резистентности следует дополнительно определять устойчивость к ванкомицину, линезолиду, левофлоксацину (моксифлоксацину), рифампицину, триметоприму и даптомицину.

Увеличение доли MRSA среди изолятов S. aureus должно служить сигналом для госпитального эпидемиолога направить свои усилия на идентификацию эпидемического штамма MRSA и способствовать его быстрейшей элиминации из стационара.

Следует помнить, что именно молекулярно-генетический мониторинг свойств возбудителя позволяет дифференцировать эпидемические штаммы MRSA , обнаружить появление новых штаммов, сделать научно-обоснованное заключение об источниках, путях и факторах передачи MRSA как внутри стационара, так и на территории целых регионов. Для идентификации таких штаммов следует использовать spa-типирование (определение полиморфизма гена spa методом секвенирования) в сочетании с SCCmec-типированием, или MLST-типрование, также в сочетании с SCCmec типированием. бра-сервер предоставляет возможность сопоставить данные spa-типирования с результатами MLST для наиболее распространенных spa типов.

- Читать далее "Профилактика и лечение стафилококковых инфекций"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 14.3.2020

Остались вопросы или замечания?

Все размещенные статьи преследуют образовательную цель и предназначены для лиц имеющих базовые знания в области медицины.
Без консультации лечащего врача нельзя применять на практике любой изложенный в статье факт.
Жалобы и возникшие вопросы просим присылать на адрес statii@dommedika.com
На этот же адрес ждем запросы на координаты авторов статей - быстро их предоставим.